流感裂解疫苗

生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”有關要求。

2.1生產用雞胚

毒種傳代和製備用雞胚應來源於SPF雞群。疫苗生產用雞胚應來源於封閉式房舍內飼養的健康雞群，並選用9~11日齡無畸形、血管清晰、活動的雞胚。

2.2 毒種

2.2.1 名稱和來源

生產用毒種為WHO推薦的甲型和乙型流行性感冒病毒株，經檢定證明為WHO當年推薦的病毒株或相似株。

2.2.2種子批的建立

應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”規定。以WHO推薦並提供的流感毒株代次為基礎，傳代建立主種子批和工作種子批，至成品疫苗病毒總傳代不得超過5代。

2.2.3種子批檢定

主種子批應做以下全面檢定，工作種子批應至少進行2.2.3.1-2.2.3.5項檢定。

2.2.3.1 鑒別試驗

血凝素型別鑒定：應用相應（亞）型流感病毒特異性免疫血清進行血凝抑制試驗，結果應證明其抗原性與推薦的病毒株相一致。

2.2.3.2 病毒滴度

應用雞胚半數感染劑量法（EID50）檢查，病毒滴度應不低於6.5LgEID50/ml。

2.2.3.3 血凝滴度

採用血凝法檢測，血凝滴度應不低於1：160。

2.2.3.4無菌檢查

依法檢查（附錄XII A），應符合規定。

2.2.3.5支原體檢查

依法檢查（附錄XII B），應符合規定。

2.2.3.6 外源性禽白血病病毒檢測

用相應（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和病毒后，接種SPF雞胚細胞，經培養，用酶聯免疫法檢測培養物，結果應為陰性。

2.2.3.7 外源性禽腺病毒檢測

用相應（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和病毒后，接種SPF雞胚肝細胞，經培養，分別用適宜的血清學方法檢測其培養物中的I型和III型禽腺病毒，結果均應陰性。

2.2.4 毒種保存

凍干毒種應於－20℃以下保存，液體毒種應於－60℃以下保存。

2.3 單價病毒原液

2.3.1 病毒接種和培養

於雞胚尿囊腔接種經適當稀釋的工作種子批毒種，置33～35oC培養48~72小時。一次未使用完的工作種子批毒種，不得再回凍繼續使用。

2.3.2 病毒收穫

篩選活雞胚，置2~8oC一定時間冷胚后，收穫尿囊液於容器內。逐容器取樣進行尿囊收穫液檢定。

2.3.3 尿囊收穫液檢定

2.3.3.1 微生物限度檢查

菌數應小於105CFU/ml，沙門氏菌檢測應為陰性（附錄XII G）。

2.3.3.2 血凝滴度

按2.2.3.3項進行，應不低於1：160。

2.3.4 尿囊收穫液合併

每個收穫容器的含單型流感病毒的尿囊液檢定合格后可合併為單價病毒合併液。

2.3.5 病毒滅活

在規定的蛋白質含量範圍內進行病毒滅活。單價病毒合併液中加入終濃度不高於0.2mg/ml的甲醛，置適宜的溫度下進行病毒滅活，滅活到期后，每個病毒滅活容器應立即取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗，並進行細菌內毒素含量測定。（也可在純化后或純化過程中加入適宜濃度的甲醛溶液進行病毒滅活）。

2.3.6 濃縮及純化

2.3.6.1超濾濃縮

採用離心或其他適宜的方法，將單價病毒合併液進行澄清后，採用超濾法將病毒液濃縮至適宜蛋白質含量範圍。濃縮后的病毒液應取樣進行細菌內毒素含量測定。

2.3.6.2 純化

超濾濃縮后的單價病毒合併液可採用柱色譜法或蔗糖密度區帶離心法進行純化，採用蔗糖密度區帶離心法法進行純化的應用超濾法去除蔗糖。純化后取樣進行蛋白質含量測定。

2.3.7病毒裂解

應在規定的蛋白質含量範圍內進行病毒裂解。將純化后的單價病毒合併液中加入適宜濃度的裂解劑，在適宜條件下進行病毒裂解。

2.3.8裂解后純化

採用柱色譜法或蔗糖密度梯度離心法以及其他適宜的方法進行病毒裂解后的再純化，採用蔗糖密度區帶離心法進行純化的應用超濾法去除蔗糖。超濾后的病毒液取樣進行細菌內毒素含量測定和微生物限度檢查，微生物限度檢查菌數應小於10CFU/ml。

2.3.9 除菌過濾

純化后的病毒裂解液經除菌過濾后，並加入適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑，即為單價病毒原液。

2.3.10 單價病毒原液檢定

按3.1項進行。

2.3.11保存

於2～8℃保存。

2.4 半成品

2.4.1 配製

根據各單價病毒原液的血凝素含量，將各型流感病毒按同一血凝素含量進行半成品配製，（血凝素配製量可在30-36ug/ml範圍內，每年各型別流感病毒株應按同一血凝素含量進行配製），可補加適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑，即為半成品。

2.4.2半成品檢定

按3.2項進行。

2.5 成品

2.5.1分批

應符合“生物製品分批規程”規定。

2.5.2分裝

應符合“生物製品分裝和凍干規程”規定。

2.5.3 規格

本品為每瓶（支）0.25ml或0.5ml。每1次人用劑量為0.25ml（6個月至3歲兒童用），含各流感病毒株血凝素應為7.5μg ；或0.5ml（成人及3歲以上兒童），含各型流感病毒株血凝素應為15μg。

2.5.4 包裝

應符合“生物製品包裝規程”規定。

3.1 單價病毒原液的檢定

3.1.1鑒別試驗

用相應（亞）型特異性免疫血清進行血凝抑制試驗或單向免疫擴散試驗（方法見3.1.3項），結果應證明抗原性與推薦流感病毒株相一致。

3.1.2病毒滅活驗證試驗

將病毒滅活后的供試品10倍系列稀釋，取原倍、10－1及10－2倍稀釋的病毒液分組接種雞胚尿囊腔，每組接種10個9~11日齡雞胚，每胚接種0.2ml，置33-35oC培養72小時。24小時內死亡的不計數，每組雞胚須至少存活80%。自存活的雞胚中每胚取0.5ml尿囊液，按組混合后，再盲傳一代，每組各接種10個胚，每胚接種0.2ml，經33-35oC培育72小時后，取尿囊液進行血凝試驗，結果應不出現血凝反應。

3.1.3血凝素含量

採用單向免疫擴散試驗檢測血凝素含量。

將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品抗體的1.5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為3mm，每孔10μl，於20-25℃放置至少18個小時。用PBS浸泡1小時后，乾燥、染色、脫色。準確測量抗原參考品和供試品形成的沉澱環的直徑，以抗原參考品形成的沉澱環的直徑對其相應抗原濃度進行直線回歸，求出直線回歸方程，代入供試品的沉澱環直徑，即可得到供試品的血凝素含量，應不低於90μg/（株﹒ml）。

3.1.4無菌檢查

依法檢查（附錄XII A），應符合規定。

3.1.5 蛋白質含量

蛋白質含量應不高於血凝素含量的4.5倍（附錄VI B 第二法）。

3.2 半成品檢定

3.2.1血凝素含量

按3.1.3項進行，各型別流感病毒株血凝素含量應為配製量的80%－120%。

3.2.2 裂解劑殘留量

採用聚山梨酯80為裂解劑的，其殘留量應小於80μg/ml（附錄VI H）；採用Triton X-100為裂解劑的，其殘留量應小於300μg/ml；採用Triton N101為裂解劑的，其殘留量應小於300μg/ml。

3.2.3無菌檢查

依法檢查（附錄XII A），應符合規定。

3.3 成品檢定

3.3.1 鑒別試驗

用相應（亞）型特異性免疫血清進行單向免疫擴散試驗，結果應證明抗原性與推薦病毒株相一致。

3.3.2 外觀

應為微乳白色液體，無異物。

3.3.3 裝量

按附錄I A裝量項進行，應不低於標示量。

3.3.4 pH值

應為6.5～8.0（附錄V A）。

3.3.5 遊離甲醛含量

應不高於50μg/ml（附錄VI L）。

3.3.6 硫柳汞含量

應不高於100μg/ml（附錄VII B）。

3.3.7 血凝素含量

按3.1.3項進行，各型別流感病毒株血凝素含量應為配製量的80%-120%。

3.3.8 總蛋白質含量

應不高於400μg/ml；並不得超過疫苗中血凝素總含量的4.5倍（附錄VI B 第二法）。

3.3.9 卵清蛋白含量

採用酶聯免疫法檢測，卵清蛋白含量應不高於500ng /ml。

3.3.10無菌檢查

依法檢查（附錄 XII A），應符合規定。

3.3.11 異常毒性檢查

依法檢查（附錄 XII F），應符合規定。

3.3.12 細菌內毒素含量

應小於20EU/ml（附錄XII E凝膠限量試驗）。

3.3.13 抗生素殘留量檢查

病毒培養過程中加入抗生素的應進行該項檢查，採用酶聯免疫法，應不高於10ng/ml。

於2-8oC避光保存和運輸。自生產之日起，有效期為12個月。