溶細胞素

在培養物中，只有糞腸球菌在有宿主細胞存在時生長才可以生成溶血毒素溶細胞素。“但很難理解細菌是如何知道那兒是否有可攻擊的細胞的”。在俄克拉荷馬大學進行的研究中，作者發現在沒有靶細胞時培養糞腸球菌，溶細胞素的兩個亞單位形成了一種抑制它進一步表達的失活的多形複合物。但在培養基質中加入紅血球時，一個亞單位與細胞結合，另一個返回去給細菌報告此細胞是可攻擊的，從而發出了生成高水平溶細胞毒素的信號，反之促進了血溶和營養成份從靶細胞中的釋放。

資深研究人員、美國波士頓哈佛大學醫學院的吉爾摩爾（MichaelS.Gilmore）告訴路透社，院內獲得性糞腸球菌是手術后感染的主要原因，“眾所周知有治療抵抗性，每年浪費了數十億醫療費用”。

海葵(Anthopleura)屬於腔腸動物門(Soelenterala)、珊瑚綱(Anthozoa),它的觸手及身體富含多肽類毒素和蛋白毒素，在受到機械或化學刺激時，便會釋放毒素用於抵禦敵害及捕捉食物。根據海葵毒素的生理作用將其分為3類:海葵神經毒素(Sea Anemone Neurotoxin,SAN)、海葵溶細胞素(Sea Anemone Cytolysin,SAC)和海葵鉀離子通道抑製劑(Sea Anemone Potassium Channel inhibitor)海葵溶細胞素是其中一類重要的毒素，具有多種生物學活性，如:溶血性、細胞毒性、心臟刺激活性、使膜去極化、阻斷鉀離子通道等。海葵溶細胞素可作為真核生物pore-forming毒素與細胞膜相互作用的研究模型，它在抗菌和抗腫瘤細胞方面也具有應用價值。作者主要介紹海葵溶細胞素的結構、功能及其藥理特徵方面的研究進展.

創傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌，存在於海水及海產品中，由Farmer等於1979年首先報道。該菌具有強烈毒性，主要引起原發性敗血症和嚴重的創口感染。敗血症多與生食含菌的牡蠣等貝類海產品有關，尤其好發於肝硬化、血色素沉著症、地中海貧血等體內荷鐵量過多的人群中，病死率超過50％。皮膚創口受海水中的創傷弧菌感染，常於24小時內迅速導致嚴重的組織壞死。創傷弧菌的確切致病機理至今尚未完全明了。溶細胞素是由結構基因vvhA編碼的一種相對分子質量為50851的細胞外蛋白質，具有水溶性，由大多數致病菌株產生，能溶解哺乳動物紅細胞及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，是創傷弧菌向胞外釋放的唯一細胞毒素，一直被認為是創傷弧菌重要的致病因子，且因其具有穿孔特性而頗受關注。目前對創傷弧菌溶細胞素的細胞毒性機制已有廣泛研究和報道，但其確切機制尚未完全明了。為了給今後研究探討創傷弧菌溶細胞素的致病機制以及製備創傷弧菌基因工程疫苗和免疫診斷試劑盒等奠定實驗基礎，本研究在我們實驗室以往工作基礎上，用工程菌BL21DE3pET-32a(+)-vvhA表達vvhA融合蛋白，對其進行純化、復性；通過台盼藍染料排斥試驗檢測vvhA融合蛋白對細胞活力的影響；分別以2，4-二硝基苯肼比色法和四苯硼鈉法測定vvhA融合蛋白對細胞LDH和K+含量的影響；採用AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式細胞術檢測並定量分析了vvhA融合蛋白對細胞凋亡的作用；通過透射電子顯微鏡觀察對vvhA融合蛋白引起細胞凋亡進行了定性研究；採用FITC-vvhA融合蛋白熒游標記激光共聚焦技術對vvhA融合蛋白對細胞的作用進行了定位研究。實驗方法：採用本實驗室構建的原核表達系統pET-32a(+)-vvhA-BL21DE3，用IPTG誘導vvhA融合蛋白表達后，以NTA-Ni親和層析柱進行分離純化，SDS-PAGE鑒定，並對純化的vvhA融合蛋白進行透析復性、濃縮和濾過除菌。分別以一定濃度或一定時間的vvhA融合蛋白孵育、及分別以一定時間的vvhA融合蛋白與鉀通道阻斷劑四乙基銨(TEA)共同孵育體外培養的人臍靜脈內皮(HUVEC)細胞，然後分別以台盼藍染料排斥試驗檢測重組融合蛋白對細胞活力的影響，以2，4-二硝基苯肼比色法和四苯硼鈉法分別測定重組融合蛋白對細胞LDH含量和K+含量的影響，採用AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式細胞術對重組融合蛋白引起的細胞凋亡作定量分析，並通過透射電子顯微鏡觀察對重組融合蛋白引起的細胞凋亡作定性研究。用FITC標記純化的vvhA融合蛋白，分別以一定的時間孵育體外培養的HUVEC細胞，最後激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC標記的vvhA融合蛋白在細胞中的分佈情況。結果:1.0、0.5和0.1mmol/LIPTG均能很好地誘導重組vvhA的表達，表達產物主要存在於菌體超聲破碎物離心后的沉澱中，表達量高達細菌總蛋白的30％～40％。vvhA融合蛋白能引起HUVEC細胞活力的降低，其對HUVEC細胞的致死效應呈劑量依賴性，濃度在0.1mg/ml以上的vvhA融合蛋白處理HUVEC細胞，能使該細胞活力降低60％以上，與正常對照細胞相比差異顯著(P＜0.01)。與正常對照細胞相比，vvhA融合蛋白處理HUVEC細胞后細胞培養液中LDH活力無明顯改變(P＞0.05)，vvhA融合蛋白單獨處理和vvhA融合蛋白、TEA共同處理以及不同處理時間的各組HUVEC細胞培養液中K+濃度均明顯增高(P＜0.01)，但各組處理細胞之間細胞培養液中K+濃度無明顯差異(P＞0.05)。經vvhA融合蛋白處理的HUVEC細胞早期凋亡率明顯高於正常對照細胞(P＜0.01)，並且vvhA融合蛋白引起HUVEC細胞的凋亡效應呈劑量依賴性和時間依賴性。經vvhA融合蛋白處理后大量HUVEC細胞出現典型的凋亡特徵性形態學改變，但未發現有細胞壞死。正常HUVEC細胞和加熒游標記透析液孵育4小時的HUVEC細胞貼壁形態舒展，激光共聚焦掃描未見熒光。加熒游標記透析液孵育並以0.1mg/ml未經熒游標記的vvhA融合蛋白處理4小時的HUVEC細胞體積變小、貼壁形態欠舒展，激光共聚焦掃描未見熒光。經0.1mg/mlFITC標記的vvhA融合蛋白分別以一定時間處理后的HUVEC細胞體積變小、貼壁形態欠舒展，激光共聚焦掃描細胞膜上及細胞內均可見到黃綠色熒光，且所見熒光呈非均勻性團塊狀分佈。其中，處理2分鐘、5分鐘、10分鐘和20分鐘的細胞分別可見少量熒光團，所見熒光團主要分佈於細胞膜上及細胞內緊挨細胞膜內側處，並見個別熒光團脫離內側細胞膜而位於細胞內更中央處；處理時間為30分鐘以上至4小時的細胞可見隨著處理時間的增加，熒光團塊逐漸增強增大、分佈逐漸增多，聚集於細胞膜下或進入細胞更內部。結論：本實驗室構建的pET-32a(+)-vvhA-BL21DE3系統在較低IPTG誘導濃度時(0.1mmol/L)也能很好地誘導vvhA融合蛋白的表達，其表達量高達細菌總蛋白30％～40％左右，並主要以包涵體形式存在。由pET-32a(+)-vvhA-BL21DE3表達的vvhA融合蛋白具有與天然創傷弧菌溶細胞素相似的細胞毒性。vvhA融合蛋白可導致HUVEC細胞內K+外流但未引起細胞內LDH的外泄，其引起的HUVEC細胞內K+外流快速短暫、無時間依賴性且不受鈣依賴性鉀通道阻斷劑TEA的影響。vvhA融合蛋白主要通過凋亡途徑引起HUVEC細胞損傷。vvhA融合蛋白結合於HUVEC細胞細胞膜表面並能進入細胞內，其在細胞膜表面及細胞內均聚集成團塊狀。