寡核苷酸探針
寡核苷酸探針
寡核苷酸探針(oligonucleotide probe) 是人工合成的由短鏈核苷酸組成的大分子(即一段比較短的DNA 或者RNA )，而且這些分子(短鏈) 被進行適當的標記，能夠與被檢測的長鏈DNA 或RNA (例如目的DNA) 的一小部分互補結合，因而能夠用於探測、鑒定長鏈核苷酸。
寡核苷酸探針是基因工程技術和分子生物學研究的重要工具。寡核苷酸的化學合成可以用高度自動化的儀器進行，因此，核酸雜交技術也得到了飛躍發展。核酸探針篩選文庫是用標記的特定DNA 或RNA 序列來檢測互補的序列。該法又分同源克隆序列、異源序列和合成寡聚核苷酸3 種檢測類型。
常用的寡核苷酸探針有3種：①特定序列的單一寡核苷酸探針；②較短的簡併性較高的成套寡核苷酸探針；③較長而簡併性較低的成套寡核苷酸探針。多用32P標記寡核苷酸探針，如：1）通過T4噬菌體多核苷酸激酶催化的磷酸化反應標記合成的寡核苷酸探針，在合成寡核苷酸時期5’端缺少一個磷酸基，因而易用T4噬菌體多核苷酸激酶進行磷酸化反應，而將α-32P從[γ-32P]ATP轉移至其5’端。這種磷酸化反應最多能使每一寡核苷酸分子中摻入一個32P原子。2）用大腸桿菌DNA聚合酶i Klenow片段標記合成的寡核苷酸探針，其比活性更高，每一寡核苷酸分子可帶有若干個放射性原子，放射性比活度可高達2×1010計數/（min·mg） 。
寡核苷酸探針的非放射性標記時，可用以下幾種方法
1．酶延伸法合成與探針目的基因的3’-端一段互補的寡核苷核序列，此序列的5’-端多加一個A，與目的基因片段退火，再用Klenow酶延伸，使bio –dUTP摻入探針的3’末端。
2．5’磷酸末端標記法帶5’-磷酸的寡核苷酸探針，在咪唑緩衝液中用水溶性碳二亞胺（EDC）處理，可生成活性的磷酸咪唑中間體，與過量的乙二胺作用，就可以引入一個帶氨基的接臂。用活化生物素標記就可以得到5’-磷酸標記的寡核苷酸探針。
3．酶標探針法用雙功能聯接劑如辛二酸雙羥基琥珀亞胺酯聯接寡核苷酸和鹼磷酶，可以生成1：1的酶標寡核苷酸探針。此法省略了生物素-親合素中間步驟，可減少非特異性反應。
4．生物素醯肼胞嘧啶修飾法在亞硫酸鹽催化下，生物素醯肼可置換寡核苷酸探針中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探針。
5．寡核苷酸的酶促加尾標記法在末端轉移酶的作用下，用非放射性物質修飾的核苷酸（生物素dATP；生物素-dUTP；地高辛-dUTP）可加到DNA的3’末端，每個探針DNA可加上10～20個修飾鹼基。
（1）取-0.5ml硅化塑料離心管，插入冰浴中，加入寡核苷酸（3pmol）×μl，5×加尾緩衝液20μl，5.0mmol/l dUTP 4μl（終濃度200μmol/L），修飾的dNTP（生物素-dUTP；生物素-dATP；地高辛-dUTP）×μl（終濃度100μmol/L），加入至100μl，混勻后加入末端轉移酶5u。37℃反應1h。
（2）探針純化：乙醇沉澱法：加入50μg tRNA，15ul 4mol/L醋酸鈉和375μl無水乙醇，混勻，-20℃1h，高速離心10min，棄上清，用70%乙醇和無水乙醇再反覆洗沉澱，晾乾，再溶於水中，濃度為500ng/ml。