單細胞測序

隨著測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億鹼基的基因組並逐個細胞比較序列正在變為現實。

目前，最常見的單細胞測序的應用是在腫瘤研究上。來自美國和英國的研究人員近日利用單細胞基因組擴增、測序和裝配，從海洋樣本中鑒定出一個單細胞細菌。

多重退火和成環循環擴增技術（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）

主要研發人：哈佛大學終身教授、美國科學院院士謝曉亮（Sunney Xie）教授

技術看點：降低PCR擴增偏倚，使得單細胞中93%的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發現個別細胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌症惡化的機制，生殖細胞形成機制，甚至是個別神經元的差異機制。

技術簡介：

PCR擴增具有偏好型而且基因組具有大量的冗餘，造成了基因組測序準確性不高。

謝曉亮研發的MALBAC技術能從一個細胞的基因組中，分離出來自單細胞的DNA，然後添加稱作引物的短DNA分子。這些引物可與DNA的隨意部分互補，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當DNA複製起點。

這些引物由兩個部分構成——一個包含8個核苷酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結合，再加上一個包含27個核苷酸的共同序列。這一共同序列可防止DNA太多次拷貝，大大地降低了擴增偏倚。通過將自身摻入到新拷貝鏈，從而自身成環，防止了過度拷貝。利用這種方法，進行與加入的引物的DNA複製時，可以完成高達93%的基因組測序。

基於晶元實驗室技術的單細胞測序

主要研發人：斯坦福大學Stephen Quake

技術看點：基於lab on a chip開發

技術簡介：

本技術設計了一種路線，用液體載運細胞通過一連串顯微管道和微閥門，當細胞挨個進入各自的小空位時，它們的DNA就會被提取出來，經過複製用於進一步分析。

此外，本技術不僅能分離細胞，還能用化學試劑將細胞混合起來，通過檢測反應過程中的熒光發射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在晶元上完成，不僅操作簡單，而且成本效益高。

Stephen Quake已利用此技術完成了第一例人類單細胞測序，現在他正利用這項技術研究精子細胞中的重組並分析突變率。

基於MDA的單細胞測序

主要研發人：深圳華大基因研究院

技術看點：將多重置換擴增(MDA)和測序技術相結合。

技術簡介：

本技術基於多重置換擴增(MDA)，並對該方法的擴增均一性、靈敏度、特異性等方面進行了全面評估。這種將多重置換擴增和測序技術相結合的單細胞測序方法不僅具有更高的解析度和基因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種複雜疾病和生物學過程的研究開闢了新思路。

Strand-seq

主要研發人：加拿大英屬哥倫比亞大學Peter Lansdorp

技術看點：能捕捉DNA一條鏈上的信息，使得研究人員能對親本DNA模板鏈進行單細胞測序，避免單細胞DNA擴增和測序時丟失定向信息。

技術簡介：

在細胞分裂過程中，當雙螺旋解旋后，兩條染色體上的遺傳信息偶然會出現交換，如果這樣的交換水平不斷提高，就標誌著出現了DNA損傷和癌症。傳統的基因組測序，由於在單細胞DNA擴增和測序的時候，會丟失定向信息，難以檢測到基因重排，因此也就檢測不出這一點。

Strand-seq方法能分別對單細胞的雙親DNA模板鏈進行測序，獲得高解析度的姊妹染色體交換圖譜，檢測到基因重排，從而發現細胞複製過程中，DNA序列的翻轉或交換。

利用Strand-seq方法，研究人員完成了單鏈DNA測序，並發現了首個基因組壓力和不穩定性的痕迹。

來自斯坦福大學的Stephen Quake測定了來自一項研究的100個精子的重組率，發現了許多新的重組熱點和與間接方法發現的相一致的比率。隨後他更深程度地測序了8個精子足以確定突變率。他在會議上報告說發現其比率為每10億個鹼基為30個變異，略高於其他人所發現的。

紐約冷泉港實驗室的研究生Timour Baslan正利用單細胞技術來研究癌細胞。他與MD安德森癌症中心的分子遺傳學家Nicholas Navin展開了合作。Navin實驗室曾開發一種所謂的單核測序（single-nucleus sequencing）技術繪製腫瘤圖譜。他們已利用這一技術追查了癌症的進化，追蹤了癌症隨時間和擴散越來越普遍時不同的細胞亞群。Baslan和同事們現在在測序前會將遺傳條形碼添加到每個細胞上，這樣使得他們能夠將樣本集中在一起進行測序，仍然能夠識別在混合物中來自單個細胞的序列，一種節約成本的測量。

馬里蘭州貝塞斯達國家人類基因組研究所的遺傳學家Elaine Ostrander稱分析單個癌細胞的前景“令人難以置信的興奮“，以一種“充滿希望和優雅”的方式解析了正在腫瘤中發生的事件。但是另一些人則更為謹慎。“得到這些類型的數據是很難的，因為你將不得不對大量的細胞進行測序，”華盛頓大學基因組研究所共同負責人Elaine Mardis說。

哈佛大學謝曉亮院士科研團隊於2012年12月21日在《Science》發表一篇關於MALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）的方法論文章，該方法解決了單細胞微量初始模板進行基因組擴增時過大的擴增偏倚，使基因組測序的模板需求量從µg級降至單細胞水平。該技術在研究人類精子重組方面的獨特應用也在頂級科學期刊《Science》公開發表。

“MALBAC開啟了一扇通往許多重要問題的大門，”加州大學聖地亞哥分校任兵（Bing Ren）說。例如，可用它來檢測突變累積的速度，尋找一個細胞群中的基因拷貝數變異和染色體異常。相比其他測序方法，它還可以幫助檢測更多基因組的變異。

“我認為人們將會立即開始利用它，” James Eberwine說。Eberwine在賓夕法尼亞大學Perelman醫學院從事單細胞遺傳學研究。他補充說研究人員或許不得不調整條件，例如引物與基因組DNA的比率，從而能夠開展實驗工作。

癌症單細胞測序

單細胞測序方法即single cell sequencing（SNS），能準確定量一個單細胞核中基因拷貝數目。由於癌細胞中基因組部分被刪除，或者擴增，從而引起關鍵基因的缺失，或者表達過量，干擾正常細胞生長，因此利用這種方法就能分析基因拷貝數目，從而診斷癌症。