限制片段長度多態性

RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點鹼基發生突變，或酶切位點之間發生了鹼基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關係。

所用的探針為來源於同種或不同種基因組DNA的克隆，位於染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位於分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。

一、材料

基因組DNA(大於50kb,分別來自不同的材料)。

二、設備

電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5隻，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、試劑：

1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩衝液。

2、5×TBE電泳緩衝液：配方見第一章。

3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。

4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。

5、10×SSC：配方見第九章。

6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。

四. 操作步驟

1. 基因組DNA的酶解

(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗，要求提取的DNA分子量大於50kb, 沒有降解。

(2) 在50μl反應體系中，進行酶切反應:

5μg基因組DNA

5μl 10×酶切緩衝液

20單位（U）限制酶(任意一種)

加ddH2 O, 至50μl

(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。

(4) 取5μl反應液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大於30kb的明顯亮帶出現。

[注意] 未酶切的DNA要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。

2. Southern轉移

（1）酶解的DNA經0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。

（2）將凝膠塊浸沒於0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。

（3）取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45分鐘。經蒸餾水漂洗後轉至中和液中和30分鐘。

（4）預先將尼龍膜，濾紙浸入水中，再浸入10×SSC中，將一玻璃板架於盆中鋪一層濾紙(橋)然後將膠塊反轉放置，蓋上尼龍膜，上覆二層濾紙，再加蓋吸水紙，壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印，維持18-24小時。也可用電轉移或真空轉移。

（5）取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。

（6）將膜夾於2層濾紙內, 80℃真空乾燥2小時。

（7）探針的製備和雜交見第九章分子雜交部分。

[注意]

1、步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。

2、除步驟（1）、（4）、（5）外, 其餘均在搖床上進行操作。

3、步驟（4）中，當尼龍膜覆於膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發生, 加蓋濾時也不應有氣泡發生。

4、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP的差異，這時應該試用另一種酶。