酶切

酶切

酶切是對粘末端的DNA分子和載體分子進行切割,以獲得相應的粘末端連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,雙酶切困難。

具體措施


酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,但雙酶切如果兩種酶所用緩衝液成分不同(主要是鹽離子濃度不同)或反應溫度不同,這時可以採用如下措施解決:1)先用一種酶切,然後乙醇沉澱回收DNA分子后再用另外一種酶切;2)先進行低鹽要求的酶酶切,然後添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求,加入第二種酶進行酶切;3)使用通用緩衝液進行雙酶切片。具體要根據酶的反應要求進行,盡量避免活力損失。

主要步驟


一、實驗材料準備
1. 材料:質粒DNA。
2. 試劑:限制性內切酶、ddH2O。
3 . 儀器:微量移液槍,離心機,水浴鍋,電泳儀,紫外透射觀測儀。
二、單酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:
(1)質粒DNA:X μL(約1 μg)。
(2)限制性內切酶:1 μL(約10 U)。
(3)10×buffer:2 μL。
(4)ddH2O不補足20 μL。
2. 混勻,做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 mi終止止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
三、雙酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:
(1)質粒DNA:X μL(約1 μg)。
(2)限制性內切酶1:1 μL(約10 U)。
(3)限制性內切酶2:1 μL(約10 U)
(3)10×buffer:1或2 μL。
(4)ddH2O不補足20 μL。
2. 混勻,做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 mi終止止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
四、結果與分析
假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點,且酶切徹底,紫外燈下檢測電泳結果,則單酶切應為一條帶,而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多於理論值,那麼有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣(超螺旋、線性和開環三條帶),則說明質粒完全沒有被切開。