酶切

酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩衝液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以採用如下措施解決：1）先用一種酶切，然後乙醇沉澱回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然後添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩衝液進行雙酶切片。具體要根據酶的反應要求進行，盡量避免活力損失。

一、實驗材料準備

1. 材料：質粒DNA。

2. 試劑：限制性內切酶、ddH2O。

3 . 儀器：微量移液槍，離心機，水浴鍋，電泳儀，紫外透射觀測儀。

二、單酶切

1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：

（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。

（2）限制性內切酶：1 μL（約10 U）。

（3）10×buffer：2 μL。

（4）ddH2O不補足20 μL。

2. 混勻，做好標記。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 mi終止止反應。

5. 電泳檢測酶切效果。

三、雙酶切

1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：

（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。

（2）限制性內切酶1：1 μL（約10 U）。

（3）限制性內切酶2：1 μL（約10 U）

（3）10×buffer：1或2 μL。

（4）ddH2O不補足20 μL。

2. 混勻，做好標記。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 mi終止止反應。

5. 電泳檢測酶切效果。

四、結果與分析

假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點，且酶切徹底，紫外燈下檢測電泳結果，則單酶切應為一條帶，而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多於理論值，那麼有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環三條帶），則說明質粒完全沒有被切開。