純化抗體

製備高特異性、高效價的抗體是實驗免疫學技術的基礎，抗體質量的高低將直接影響試驗的成敗。通過不同方法製備的抗體往往與多種雜蛋白混雜在一起，為了獲得成分相對單一的抗體或將抗體用於特定的用途，就需要進行抗體純化。從成分的角度分析, 抗體分子是一類蛋白質分子，與其他蛋白質一樣，它有一定的等電點、溶解度、荷電性及疏水性，可以用電泳、鹽析沉澱或其他層析技術進行分離、純化。

純化抗體通常用於直接檢測抗原。此時抗體標記有一個易於鑒定的標記物，用於結合和檢測所研究的抗原。在間接檢測抗原方法中，一抗不被標記，而是用標記的二抗(一種抗免疫球蛋白抗體)來檢測。一般而言，建議使用間接法。因為許多商家能夠提供可靠的標記二抗，用間接法不僅省力，結果同樣可靠。儘管如此，有幾種方法需要標記的一級抗體。例如，在免疫染色試驗中，需要研究2個或2個以上抗原的相對位置時，常需要純化抗體並用不同標記物標記，這樣能比較它們的相對位置。此時使用間接法不合適。因為間接法是用標記二抗來給未標記的一抗定位。又如，有時一抗需要標記，而該樣本中又有大量無關抗體，它們能幹擾對一抗的檢測，此時用間接法也不合適。用鼠源性單抗對鼠組織抗原進行定位時，也會出現這種情況。此時需要純化一抗，並直接按下述方法進行標記。

多抗的純化是一件比較簡單的事情，因為人工干預比較大，所以對實驗者的操作依賴性較強。很多新手覺得這是一件比較複雜困難的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改進實驗了。多抗純化方法比較多，過去有用鹽析法純化的，有用辛酸-硫酸銨沉澱的方式純化的，也有用冷酒精沉澱的方式純化的，也有後來的離子交換層析和Protein A,G,A/G純化的，但是在今天，市場上幾乎所有的抗體都是通過抗原親和純化得到的，與其它方法相比，抗原親和層析得到的抗體效率高、產量高、產品純、操作簡單。

步驟如下：

1、介質的製備

2、抗原與填料的連接

3、連接效果的評估

4、多餘位點的封閉

5、抗血清與beads的結合

6、非特異性結合的抗體的洗滌

7、洗脫

具體 操作與原理可以看看中國免疫學實驗網上的詳細講解。

免疫親和純化是另一種可能需要純化抗體的技術。在這一技術中，抗體共價交聯到一固相基質上，如交連的瓊脂糖或聚丙烯醯胺微球。常用的方法是，先將抗體純化，然後連接到通過化學方法激活而具有結合位點的微球上。此時，抗體的純化對實驗的成功至關重要。

還有一種需要純化抗體的試驗，是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有複雜多樣的抗體，它不僅含有針對免疫原產生的抗體，還有血清的全部抗體。出於特定目的的需要，必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時，需要分離出特異性識別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術中，使用純化抗體都能降低非特異性本底。產生這種效果主要是因為一方面能去除引起實驗誤差的污染蛋白，另一方面能精確控制實驗中產生陽性信號的抗體量。使用純化抗體不會使本底增加，因此純化抗體可以作為所有免疫化學實驗中降低本底的基本手段。

抗體的純化通常是濃縮抗體的最簡單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。

儘管純化抗體的方法較多，建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為最常用的方法。這種方法效率高，能為常用的實驗方法提供足夠純化的抗體，而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質的出現，能將任何來源的抗體純化。抗體的純化也可採用傳統的色譜法，在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉澱法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡單，並且純化效果是其他方法的數倍。