熒光顯微鏡

熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別：

1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射於樣品上；

2.光源為紫外光，波長較短，分辨力率高於普通顯微鏡；

3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用於濾除紫外線，用以保護人眼。

熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要的區別是二者的激發波長不同。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡結構和使用方法上的不同。

熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。

多採用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃製作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外和藍紫光，足以激發各類熒光物質，因此，為熒光顯微鏡普遍採用。

超高壓汞燈也散發大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。

新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要等15min。由於超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。

超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的系統，燈泡球部後面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。

國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。

中國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易於攜帶，使用方便，已推廣應用。

濾色系統是熒光顯微鏡的重要部位，由激發濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，後面字母代表玻璃，數字代表型號特點。如德國產品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；中國產品的名稱已統一用拼音字母表示，如相當於BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當於BG12。

1．激發濾板 根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長範圍的激發光。

紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。

最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。

開始採用金屬膜干涉濾板，由於針對性強，波長適當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。

激發濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

2．壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應波長範圍的熒光。與激發濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：

紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上波長的光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。

反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。

專為熒光顯微鏡設計製作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃製成。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適於低、中倍放大的標本觀察。

2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發光也不進入目鏡，可以使用薄的激發濾板，增強激發光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質量，觀察舒適，可能發現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。

3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助於熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長範圍）適合於熒光。由於圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以儘可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分（紫外和紫藍）由於濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經物鏡射向標本，使標本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發濾板作用，由於標本的熒光處在可見光長波區，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用於不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀察。研製的新型熒光顯微鏡多採用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。

熒光顯微CCD是與熒光顯微鏡密切相關的數碼攝像產品，一方面它可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產品通過usb介面傳輸到電腦中，便於圖像的採集研究，另一方面，通過熒光顯微鏡CCD可以拍攝到比單純使用熒光顯微鏡更好的圖片。熒光顯微鏡CCD可以連接熒光顯微鏡組成顯微成像系統。

一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡即可以達到想要的成像效果，但在某些情況下，比如說當熒光比較微弱的情況下，僅僅通過熒光顯微鏡並不能達到理想的拍攝效果，或者大家希望可以將拍攝的熒光圖片上傳的電腦生面預覽，修改甚至發表學術論文，這時候沒有熒光顯微鏡CCD是不能達到要求的。

熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕捉能力，能夠捕捉到極其微弱的熒光，因此成像能力好，此外，很多熒光冷CCD生產上搜對此類CCD作了製冷處理，使得此類CCD的噪音大大降低，信噪比得以很大的提高。由於其方便應用效果，此類CCD相機被廣泛應用於熒光顯微鏡。

熒光顯微鏡的標本製作要求

1、載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用於涉蓋玻片，這是一種特製的表面鍍有若干層對不同波長的光起到不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本。

3、標本

組織切片或其他標本不能太厚，若太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重疊或雜質掩蓋，影響判斷。

4、封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。

5、鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特製的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。

（1）打開燈源，超高壓汞燈要預熱15min才能達到最亮點。

（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的後面裝上相應的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。

（3）用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位於整個照明光斑的中央。

（4）放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。

（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，觀察到經0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。

（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。

（6）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。長時間的激發光照射標本，會使得熒光衰減和消失現象，故應儘可能縮短照射時間。暫時不觀察時可用擋光板遮蓋激發光。

（7）標本觀察時候應採用無熒光油，應避免眼睛直視紫外光源。

（8）電源應安裝穩壓器，電壓不穩會降低熒光燈的壽命。