免疫沉澱

免疫沉澱的成功依賴於抗原的純度以及製備抗體的難易，主要受兩方面因素的影響：1、抗原原液的丰度，2、抗體對抗原的親和力。

有3種類型的抗體可用於免疫沉澱：多克隆抗體，混合單克隆抗體和單克隆抗體。

多抗的本底較高，可通過滴定產生免疫沉澱所需的抗血清量，來有效地清除某些非特異性本底。其方法是將特異性抗體降低到能定量結合抗原的最低滴度，使本底保持最低。

免疫沉澱要求抗原的純度儘可能提高。降低本底，用不與待檢抗原結合的非特異性抗體預處理，可以從抗原溶液中除去非特異性結合蛋白，即此法第一次是用非免疫抗體降低本底，第二次再用所研究的抗體，這樣進行二次免疫沉澱是達到純化免疫沉澱物最有效的方法。

（1）收穫細胞，加入適量細胞IP裂解緩衝液（含蛋白酶抑製劑） ，冰上或者4℃裂解30min, 12,000g離心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩餘裂解液將1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

（3）免疫沉澱反應后，在4°C 以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩衝液洗3-4次；最後加入15μl的2×SDS 加樣緩衝液，沸水煮10分鐘；

（4）SDS-PAGE, Western blotting或進行質譜分析。

免疫沉澱的實驗過程比較簡單，一般分為3個階段；①抗原溶液的製備；②裂解物非特異性本底的預處理；③免疫複合物的形成與純化。免疫沉澱的第一步是製備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉澱的材料來源，但免疫沉澱一般採用細胞或組織製備的裂解物。裂解物的製備可採用多種方法，其中首選用溫和的去污劑如非離子去污劑來裂解細胞。該方法能溶解細胞膜，破壞蛋白質之間許多微弱的相互作用，釋放出大多數細胞內抗原。更重要的是方法十分溫和，不破壞大多數抗原的結構和酶的活力。如果對抗原結構的完整或活力要求不嚴，或者抗原結合較為緊密，可以採用比較劇烈的條件來製備裂解物，如在強變性劑的溶液中進行煮沸，然後在免疫沉澱前經過稀釋去除變性劑。一旦細胞裂解液製備好，即可進行預處理。

免疫沉澱一般用於分析抗原的生化特性，因此要求抗原的純度儘可能高。抗原和抗體的相互作用與其各自的內在性質有關，故提高該技術信—噪比最容易的方法是降低本底。

經過預處理后，在裂解物中加入特異性抗體，由於抗體對其相應抗原的高度親和力，因此容易快速形成免疫複合物。然後，將免疫複合物經蛋白A或蛋白G結合的瓊脂糖或聚丙烯醯胺微珠等固相基質進行純化。蛋白A和蛋白G對抗體的Fc段有較高的親和力。蛋白A/G與抗體結合后，通過洗滌微珠即可除去未結合的蛋白，剩下與基質結合的即是純化的抗原抗體複合物。