熒光定量

1.必須確定擴增的特異性；

2.只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同）；

3.的某次放大隻是理論值，實際擴增效率低於；

4.避免試用用Syber Green。

熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒游標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR 反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，結合相應的軟體對產物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍，運用該項技術，可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析。

1．相對定量

包括RNA提取、反轉錄和擴增，採用SYBR Green I法和TaqMan探針法兩種方式，一般採用2法進行計算。每個樣本重複三次，一般情況我公司提供內參基因引物。

2．絕對定量

需要製備標準品並建立標準曲線，然後檢測目的樣本中的基因，比對標準曲線得到基因準確拷貝數。

細胞（≥10 ）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、葉片（≥100mg）等樣品材料，基因組DNA或總RNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。

引物和探針及序列，反轉錄膠圖，原始數據（包括擴增曲線和熔解曲線）、數據分析結果及實驗報告。