3D細胞培養

3D細胞培養，又稱三維細胞培養，我們日常所應用最多的是用培養皿或培養板中進行培養，人體是不斷處於動態的，所以為了更加接近人體或動物最真實的細胞生長環境，科研工作者提出了大量的解決方法，如添加力學/磁場/電場等等，為細胞的研究提供更多的研究方法和手段。米力光CO.LTD目前添加力學因素有拉伸或壓縮/旋轉/流動等力學環境，我們常見的產品有三維拉伸應力儀/三維壓縮應力儀/壁式旋轉培養儀/三維自由旋轉微重力培養儀/磁懸浮三維培養儀/三維培養水凝膠支架/3D組織工程支架印表機等等。

目前最接近人體真實生理環境的手段有磁懸浮三維培養等等。

傳統細胞培養技術在模擬細胞體內生存環境方面做得還不夠。3D細胞培養技術的發明就是為了在細胞培養過程中，為細胞提供一個更加接近體內生存條件的微環境。

細胞培養技術的進步意味著科學家們對細胞培養基的成分有了更深入的了解和認識，讓細胞有一個更加天然的生長環境，即便在實驗室里也不例外。因為細胞可以在實驗室條件下生長和培 養，這讓科學家們的科研工作容易了許多，所 以科研人員都希望細胞能夠在實驗室里更好地 生長下去；同樣的道理，如果科研人員不能提 供一個適宜細胞生長的環境，那麼他們的科學 研究工作就會遇到障礙。因此，細胞培養基（culture media）市場 是一個非常活躍的市場，科研人員希望在實驗室里培養各種細胞，所以市面上也就出現了各 個試劑生產廠家提供的各種各樣的細胞培養基 商品，甚至還有一些“獨家秘方”產品出售，這些產品為實驗室里培養的各種細胞提供了充 足的“口糧”。不過細胞培養工作更依賴經驗 的積累，所以培養細胞更像是一門藝術，而不 是一種高度可重複的科學，很難通過一套方法 或者理論選擇出合適的培養基。細胞培養基上的即便極其細微的差別都會 對細胞的生長帶來明顯的影響，但是具體的 原因現在還不清楚。所以很多科研工作者在培 養細胞時都會使用自己的“獨家秘方”，但這 樣做就違背了科學的基本準則——可重複性原 則。英國倫敦大學學院（University College London）的試驗病理學家，同時也是多本有 關動物細胞及人類細胞培養學術專著編委之一 的 John Masters 就認為，這種“獨家秘方”式的培養基是很難重複的，因為即便是同一個 人配製的獨家培養基，各批次之間也會因為配 方各成分的絕對含量有所不同而出現差異，而 且從不同的供應商那裡買來的各配方組分，或 者是采自同一家供應商，但是不同批次的各配方組分的純度和含量也都會出現偏差。而且我 們都知道，在配製少量化學混合溶液時是最容 易出現各批次產品的質量不均一的情況的。不過隨著對培養基成分的重要性有了不斷 深入的認識，科學家們也越來越意識到這個問 題的重要性，對培養基成分的標準也正變得越 來越嚴格。比如有一些科研人員就正在嘗試徹 底去除培養基中的動物來源組份，因為他們擔 心它們會“污染”或者影響應用於臨床治療的 細胞系產品。還有一些科研人員則正在努力通 過人工培養技術模擬出天然細胞的生長環境，比如我們下面將要介紹的三維立體細胞培養技 術（three-dimensional tissue structures, 3D tissue structures）。有很多細胞是不能（很難）在實驗室里培養的細胞培養技術非常重要，這一點在正蓬勃發展的誘導多潛能幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）研究領域顯得更 加突出。使用這種幹細胞技術可以將成體已分 化細胞（adult cell）的分子時鐘往回撥，讓它 們倒回到最初的狀態，即未分化之前的狀態，這樣，這些已分化的細胞就又可以進行新一輪 的分化，形成各種終末細胞。這項新技術對於再生醫學（regenerative medicine）領域意義重大，我們可以用這項技術在實驗室里重新培 養出各種“新鮮的”組織，用於治療組織受損 的患者。比如日本神戶的 RIKEN 發育生物學研 究中心（ RIKEN Center for Developmental Biology in Kobe, Japan）的眼科學研究專家 Masayo Takahashi 就正在申請開展全球首 例基於誘導多潛能幹細胞技術的臨床治療試 驗，他將用這項技術對老年黃斑變性（age-related macular degeneration）患者進行治 療。我們知道老年黃斑變性這種疾病會讓患者的視網膜（retina）壞死， Takahashi 的治療 策略就是對患者自身的皮膚細胞進行重編程（reprogrammed）操作，然後用得到的新生 視網膜組織替換患者眼內已經壞死的視網膜組織。與此同時，世界上還有一群科學家在嘗試另外一個方向，這就是轉分化（transdifferentiation）技術，即通過遺傳學 方法讓一種已分化細胞轉變成另外一種已分化 細胞的方法，這種方法和誘導多潛能幹細胞方 法相比，省掉了中間的幹細胞環節。其中最具 代表性的工作就是由美國馬薩諸塞州坎布里 奇白頭生物醫學研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts）的 Rudolf Jaenisch 和 Yosef Buganim 開展的工作。Jaenisch 等人利用細胞 培養技術將結締組織細胞（connective-tissue cell）轉化成了能夠表達 Sertoli 細胞（這是一 種主要見於睾丸組織的細胞）特徵標誌物的細胞。這一研究成果有助於我們了解男性不育症的發病機制，也可以幫助我們開發出新的細胞 培養技術，讓以往不能，或者很難在實驗室里 進行培養的細胞走進科學家們的培養箱。Buganim 表示，培養條件能夠決定培養細 胞的命運。因為轉分化細胞、誘導多潛能幹細 胞或者體外培養的神經元細胞，每一種細胞都 有自己特定的需求，所以也需要給予不同的培 養基和培養條件。比如每一種細胞需要的生長 因子不一樣，有的細胞可能需要這一種生長因 子；有的細胞又不能給那一種生長因子；有的 細胞需要較高濃度的氧；有的細胞則需要較低 濃度的氧，這些因素都會影響到細胞的正常狀 態和特性。不過據美國威斯康辛州麥迪遜市 Primorigen 生物科技公司（ Primorigen Biosciences in Madison, Wisconsin）的技術 及市場開發部經理BradleyGarcia介紹，干細 胞研究人員更加需要的是能夠維持幹細胞生長，並且誘導幹細胞定向發育、分化的培養基 和培養技術。 Primorigen 生物科技公司的主要 業務就是開發並銷售這一類的產品。如果培養 基能滿足細胞的要求，那麼分化的幹細胞—— 無論是幹細胞、心臟細胞還是神經細胞，都有 可能在培養基中生存數天、數月甚至一年以 上。細胞的生長是不可預測的，它們在這一種 培養基里的生長速度可能要比在那一種培養基 里快很多，但是沒人知道這是為什麼。而且據 Primorigen 生物科技公司產品開發部的高級經 理 Scott Monsma 介紹，幹細胞在這方面的表 現更加突出，它們會對不同的培養條件（比如 培養操作不精細、細胞生長太密或者存在應激 刺激等）做出反應，進而發生相應的分化。由 於存在這些因素，所以開發幹細胞培養基非常 困難，但是這方面的市場需求卻相當大，因為 幹細胞在醫療上的應用潛力是無限的。少而精的培養基還有一些科研人員使用供給培養系統（feeder-based system）進行幹細胞培養。在這套培養系統里會使用一些支持細胞（supporting cell），比如小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast）等，讓這些細胞分泌生長因子供人工培養的幹細胞使用。但是據銷售幹細胞培養基的加拿大溫哥華英屬哥倫比亞腫瘤研究所附屬幹細胞技術研發中心（research and development at Stem cell Technologies, aspin-off from the British Columbia Cancer Agency that is based in Vancouver, Canada）的資深科學家 Erik Hadley 介紹，這種方法非常容易出問題。這不僅僅是因為每一批支持細胞會有所不同，而且很難控制由這些支持細胞分泌的生長因子的數量以及生長因子分泌的時機，所以也就無從談起哪一些生長因子（培養成分）才是幹細胞進行某種分化時必需的了。 Glauco Souza 開發出了一種能夠模擬體內環境和蛋白質分泌情況的微組織（microtissues）細胞培養技術。為了解決這個問題，幹細胞技術研發中心專門開發了一種不含供給細胞的幹細胞維持培養基（feeder-free stem-cell maintenance medium），這就是市面上銷售的 mTeSR1 培養基。此後開發的第二代產品 TeSR2 培養基更是完全不含任何的動物來源蛋白。在 2013 年 1 月新推出的 TeSR-E8 培養基則只含有 8 種組份，這是根據美國威斯康星大學麥迪遜分校（University of Wisconsin - Madison）的幹細胞研究專家 James Thomson 提供的專利配方開發的新產品。美國加利福尼亞州生命科技公司（Life Technologies in Carlsbad, California）也推出了一款同樣的產品，他們稱之為 Essential 8 Medium。美國休斯敦得克薩斯大學健康科學中心（University of Texas Health Science Center in Houston）的幹細胞研究專家 Mikhail Kolonin 認為，這種成分確定的培養基產品的出現終於讓細胞培養操作走出了“煉丹”時代，也讓細胞培養試驗和臨床應用結果更具可重複性。不含動物成分的醫藥產品 這是一幅經過藝術加工的肝癌細胞掃描電鏡顯微 照片（scanning electron micrograph）。據 Monsma 介紹，供給培養系統除了存在 上述這些問題之外，還有一個因素也是影響 試驗可重複性的攔路虎，那就是在幹細胞培 養基中常用的胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）中含有的生長因子、蛋白質和其它的營 養成分。在幹細胞培養基中，胎牛血清通常都 達到了 20% 的比例。每一個批次的胎牛血清 產品都來自不同的胎牛，所以它們的組份必然 或多或少會存在一些差異。據 Kolonin 介紹，問題在於他們根本不知道這些組份出現了哪些改變。這也正是關注幹細胞臨床應用問題的干 細胞研究者在使用含血清的培養基時格外謹慎的原因之一。Kolonin 還介紹了另外一個原因，那 就是使用含動物來源成份的培養基培養出來的細胞在應用於臨床組織移植（tissue transplantation）時有誘發受體出現免疫排斥反應的風險。總部位於美國馬薩諸塞州的 Thermo Fisher Scientific 公司（Thermo Fisher Scientific, headquartered in Waltham, Massachusetts）細胞培養及生物工藝業務部 的產品經理 Nathan Allen 還提到了另外一種可能，那就是污染（Contamination），這也是一大風險，而且會帶來更為嚴重的後果，比如瘋牛病（mad cow disease）就是一個極好的 例子。在英國爆發的變異型克雅氏病（variant Creutzfeldt-Jakob disease），即瘋牛病就是 因為人食用了被感染了瘋牛病的牛肉製品污染 的食物而導致的。美國食品與藥品監督管理局（FDA）已經禁止醫藥產品供應商使用含動物來源物質 的材料。這一禁令的出台也給臨床前研究（preclinical research）帶來了一定的影響，因為據 Thermo Fisher Scientific 公司產品開發部的 Roberta Morris 介紹，在開發新產品時，最理想的狀態就是在新產品、新技術開發的初 期，提前考慮今後進行大規模工業化生產的需要。所以 Allen 認為，基於這個考慮，今後開發的細胞培養基新產品都應該是不含動物血清的產品。 Allen 的公司現在已經推出了好幾款不含動物血清，以及不含任何動物來源成分的細胞培養基產品。但是要完全不含動物來源成分可不容易，這至少意味著需要重新進行大量的工作對培養基配方進行優化，而且這還會影響到後續的生產工藝，並且造成其它影響。上述所有特質會使新產品的價格居高不下。去年秋天，美國密蘇里州聖路易斯的 Sigma-Aldrich 公司（Sigma-Aldrichin St Louis, Missouri）啟動了幹細胞維持培養基產品的開發工作，這也是該公司推出的幹細胞產品系列中的一個組成部分。據該公司的首席科學官 Dan Allison 介紹，雖然這種培養基並不是完全不含動物來源成分的培養基產品，而且其中的所有成分都是已知的，而且絕對不含任何的、在其它配方培養基中常見的粗製蛋白（crude protein）成分，比如血清提取物或者腦垂體提取物（pituitary extracts）等。這些產品都是專門為了滿足旨在開發幹細胞應用產品實驗室的細胞培養需要，以及需要大量培養 基的用戶而開發的。Monsma 表示，僅僅使用化學試劑和非動物來源的原料來開發完全不含動物來源成分的細胞培養基產品，意味著需要使用由人體細胞或者細菌表達並純化的蛋白原料，比如人體血清白蛋白或者各種重組生長因子等蛋白。他們公司和其他一些公司正在從事這方面的工作。比如 Primorigen 公司就正在與好幾個大學的實驗室合作，將一種促幹細胞分化的培養基（differentiation medium）改造成不含動物來源成分的培養基新產品。對於從事幹細胞研究的科研工作者而言，培養基發生這種改變意味著他們的實驗室里今後也將不再需要某些試驗材料，比如小鼠胚胎成纖維細胞等支持細胞。另外，在實驗室里還有一些傳統的試驗材料，比如用於覆蓋細胞培養皿內表面的材料等也都是含有動物來源成分的。之前由美國新澤西州的Becton Dickinson 公司（Becton, Dickin sonof Frankl in Lakes, NewJersey，該公司已經在去年秋天被美國紐約的 Corning 公司收購）生產的 Matrigel 就是一種源自小鼠腫瘤組織的產品，它主要被用來覆蓋細胞培養皿的內表面，提供一層供培養細胞生長的基質。美國密歇根大學安娜堡分校（University of Michigan in AnnArbor）的科研人員早就發現，雖然使用 Matrigel 可以幫助 科研人員確定誘導多潛能幹細胞需要哪些培養成分，但是如果培養的幹細胞將來被應用於人 體，那麼 Matrigel 的動物來源屬性，及其不穩定性都會成為一個大問題。工業化生產的細胞培養基還有一部分科研人員只喜歡使用他們自己配製的細胞培養基。據 Masters 介紹，這一部分人都是有豐富細胞培養經驗的人，他們很清楚自己在幹什麼。不過 Masters 也補充說：“但是在這群人中，絕大部分的人都只知其然而不知其所以然，而且他們對培養基的配製原理也不感興趣，只關心培養基是否好用。”不過他們也想買到商品化的細胞培養基。現在已經有公司開始為這群人提供培養基訂製服務。在接受《自然》（Nature）雜誌採訪的公司當中就有公司表示他們提供的產品要比科研人員自己配製的更好，因為從原材料的檢測、儲存和配製過程，他們都有更為嚴格的質量控制流程，而且整個生產過程也都是在更加嚴格、穩定的環境中進行的。使用工業化生產的細胞培養基會更好。比如在實驗室里，細胞都是低溫保存在液氮里的，每個人使用的低溫保存培養基（cryopreservation media）也都不一樣，其中就包括自己配製的低溫保存培養基。但是據Hadley介紹，這樣保存的細胞在解凍時會損失很大一部分，這是從事細胞培養工作的科研人員面臨的一大問題。不過 Thermo Fisher 公司在 2012 年底推出了一款不含血清，也不含動物來源成分的低溫保存培養基產品 HyCryo（該產品主要用於普通細胞系細胞），以及另外一款專用於幹細胞凍存的 HyCryo-STEM 產品。使用 HyCryo-STEM 可以極大地改善凍存幹細胞解凍、復甦之後的復原速度。據 Thermo Fisher 公司的細胞培養專家 Cindy Neeley 介紹，過去科研人員在復甦神經幹細胞時只有 10-20% 的細胞會存活，不論使用哪種凍存培養基，包括所謂的獨家秘方培養基，基本上都不能解決這個問題。然而使用 HyCryo-STEM 之後，細胞復甦之後的存活比例就可以提高到 50-60%。幹細胞一般都儲存在 −196℃ 的液氮里，但是這種方法的復甦效率非常低。改善細胞培養環境也意味著對細胞培養器皿進行改良。比如 Corning 公司的生物工程師Po Ki Yuen 就通過工程學方法新開發出了一款 96 孔細胞培養板，這種培養板能夠為細胞提供營養，同時還可以去除細胞生長過程中產生的有毒廢物，更神奇的是，這種培養板還可以在不使用外部泵的情況下自動更換培養基。據 Yuen 介紹，使用這種培養板不僅可以減少培養基每天的使用量，而且還可以最大限度地減少人工操作的次數，減少細胞污染的機會，除此之外，這種培養板還可以模擬人體內的體液流動運動，這也是以往實驗室培養系統所不具備的一項功能。Yuen 還介紹說，他是在和另外兩位同事召開新產品開發研討會時突然有了開發這種細胞培養板的靈感，讓他想到可以利用裝載不同液體量的培養孔孔壁之間的壓力差。通過連接在培養孔之間的由纖維素膜（cellulose membrane）或濾紙構成的窄紙條，培養基就可以從液面較高的培養孔單向流動到液面較低的培養孔，直至最後所有孔的液面全都達成一致。據 Yuen 介紹，培養基在他們這種培養板里的流速是可以人為控制的，只需要控制相鄰孔之間的液面差高度以及連接在孔之間的濾紙條的寬度和孔徑就可以了。據 Corning 公司的產品開發經理 Brian Douglass 介紹，目前這種 96 孔板還沒有推向市場，但是使用相同技術的 6 孔細胞培養板已經開始銷售了。使用這種6孔培養板最長可以 72 小時不需要人工換液，對於科研人員來說，這就意味著他們可以輕輕鬆鬆地回家過周末了。三維立體細胞培養技術科學家們和生物技術公司還開發出了一種三維立體細胞培養技術，使用這種技術可以讓細胞聚集生長，形成組織樣結構，這樣有助於細胞之間緊密連接，促進細胞之間的信息交流。使用這種三維立體細胞培養技術，幹細胞可以生長成球形的胚狀體結構（embryoidbodies），而這種結構正是幹細胞分化發育過程中必經的一個階段。據 Neeley 介紹，這意味著使用這種三維立體細胞培養技術，細胞將不再與培養皿的表面接觸，因為只要與培養皿的表面有接觸，細胞就會附著在培養皿上，單層生長。 Thermo Fisher 公司也開發出了一系列的細胞培養皿和培養板產品，這些培養材料的表面都覆蓋了一層聚苯乙烯（polystyrene）材料，這起到了降低細胞附著力的作用。我們還可以使用生長支架（Scaffolds）幫助細胞成團生長，但是一旦去除生長支架，細胞的立體結構就會隨之垮掉，就好像帳篷被抽掉了支撐桿一樣。而且這些生長支架會妨礙我們在顯微鏡下對細胞進行觀察。為了滿足科學家們對三維立體細胞培養技術的需要， Thermo Fisher 公司專門開發了一種名為 Nunclon Sphera 的細胞培養板。據 Neeley 介紹，使用他們這種 Nunclon Sphera 細胞培養板，細胞將不會貼附在培養板的表面，它們會聚集在一起，形成一種球狀的三維立體結構。這樣就可以很方便地使用移液管移取細胞，不需要對細胞進行消化，也就不會破壞細胞的三維立體結構。目前已經有客戶正在對這種新型培養板進行測試（beta-testing）。其它針對細胞培養板開展的改良工作則主要集中在對基礎結構進行改造這個方向上。據美國馬里蘭州巴爾的摩約翰霍普金斯大學（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的生物學家 Ross Harrison 介紹，三維細胞培養技術其實可以追溯到100多年以前。 Harrison 就曾經在一滴懸浮的蛙淋巴液中培養過神經組織，而且還觀察到了神經細胞生出的軸突（axon）。目前瑞士一家名為 InSphero 的生物技術公司正在使用這種液滴技術開發細胞立體培養板產品，這種培養板還是會使用傳統的聚苯乙烯材料，但是因為採用了全新的設計，所以能夠達到讓細胞立體生長的目的。據 InSphero 公司的創始人，之前就職於瑞士蘇黎士大學（University of Zurich）的生物技術專家 Jens Kelm 介紹，在他和蘇黎士大學的同事 Wolfgang Moritz 以及瑞士聯邦理工學院（Swis sFederal Institute of Technology, ETH）的工程師 Jan Lichtenberg 拿出了原型產品之後，瑞士聯邦理工學院於四年前在大學的產業孵化器里成立了這家 InSphero 公司。InSphero 公司設計的這種培養板採用了類似於香檳酒杯的V型孔底的設計，這不同於其它培養板常用的圓底設計。據 Kelm 介紹，他們採用的這種設計讓培養板的孔底變得比較平，所以培養基液滴里的細胞就可以沉積下來，聚集成球形生長。為了讓細胞聚集成團，培養孔的開口也借鑒了窄口花瓶的方案進行了重新設計，這樣可以讓培養孔壁與移液管能夠貼合得更加緊密。科研人員發現，培養孔壁與移液管之間的密閉接觸可以讓每一個培養孔里的細胞數量接近均等，這可以讓科研人員在對不同孔之間的試驗結果進行比較時更加準確、更有意義。據 Kelm 介紹，為了達成設計目標，他們先從移液管的槍頭開始試驗，他們先將槍頭尖切掉，從上面滴入培養基液滴，然後觀察液滴是如何滴下的。2011 年， InSphero 公司和美國馬薩諸塞州的 Perkin Elmer 公司（ Perkin Elmer in Waltham, Massachusetts）達成了合作協議，那就是用 Perkin Elmer 公司生產的自動成像掃描設備直接對 InSphero 公司生產的細胞培養板進行觀察和掃描， Perkin Elmer 公司生產的自動成像掃描設備是各大藥廠的必備設備之一。這次合作讓 InSphero 公司開發出了更多的產品，比如他們設計了一款可以直接形成球形肝臟微組織（liver microtissue）的培養板，製藥公司使用這種培養板可以很方便地進行藥物毒性篩查試驗。Kelm 認為他們的技術在國際上擁有更加廣闊的市場空間。比如歐洲的法律就禁止在化妝品測試中用動物做實驗，這樣就創造了極大的市場需求，因為化妝品生產廠家需要大量的模型進行產品測試，體外培養的微組織就是一個很好的解決方案。製藥企業和化工企業也需要進行細胞學試驗檢測他們產品的毒性。此外，能夠培養幹細胞的液滴培養技術（hanging-drop technology）還可以應用於醫學應用領域。法國國家健康及醫學研究所（French National Institute of Health and Medical Research, INSERM）的生物學家 Nadia Benkirane-Jessel 使用 InSphero 的產品對如何縮短患者的骨修復時間（骨再生時間）進行了研究。為了讓骨細胞處於更利於生長的位置， Benkirane-Jessel 將骨細胞接種到了由納米纖維組成的支架上，細胞在這種支架上形成了球形三維微組織結構，然後 Benkirane-Jessel 將這種組織球移植到了試驗鼠體內。 Benkirane-Jessel 還打算用 InSphero 公司的技術為她自己成立的 Artios Nanomed 公司開發一款新產品，這款產品主要用於骨再生和軟骨再生領域。圖中所示的是結腸癌細胞，諸如此類的很多細胞都可以在缺乏生長支架的情況下聚集生長，成為圖中這種微組織（microtissues）結構。細胞漂浮培養法還有一種三維立體細胞培養技術是由美國休斯敦市的 n3D Biosciences 公司開發的， n3D Biosciences 公司也是由學術科研機構成立的一家附屬公司。據該公司的首席科學官，同時也是公司創始人之一的 Glauco Souza 介紹，使用他們的技術可以讓培養的細胞漂浮在培養基里，聚集成團生長。他們首先會用公司獨家開發的納米磁珠 NanoShuttle 對培養細胞進行修飾，這種 NanoShuttle 納米磁珠上吸附著與多聚賴氨酸（polylysine）交聯的金和鐵的氧化物。然後，他們會將培養板放置在磁場中。“將培養板置於磁場環境之中，這些納米磁珠就會懸浮起來，將細胞聚攏到一起。” Souza 介紹說。 n3D Biosciences 公司開發的最新細胞培養技術使用了納米磁珠（magnetic nanoparticle），這些納米磁珠可以在磁場的作用下懸浮起來，進而能夠將培養皿里的細胞聚集到一起。細胞之間的相互作用是促進細胞生長的重要因素之一，通過納米磁珠使細胞懸浮起來可以增加細胞之間的相互作用，與傳統的細胞培養方式相比，這種懸浮培養方式更接近體內的真實情況。而且使用這種培養板對細胞進行換液也會更方便，因為磁場可以吸住細胞組織塊，不用擔心在換液操作時被吸走。 Souza 繼續介紹道。Souza 之前是在美國休斯敦市 MD Anderson 腫瘤研究中心（MD Anderson Cancer Center in Houston）工作的一名物理化學家，據他介紹，製藥公司以及科研機構使用了他們開發的這種培養板之後都發現，培養出來的細胞組織微塊（microtissues）不論是在外型上還是在蛋白表達水平上都更加接近體內的組織，所以用這種培養板培養出來的細胞組織是一種非常好的體外藥物篩選組織模型。 n3D Biosciences 公司的細胞懸浮培養板已經打進了大學的實驗室和製藥公司，他們現在正在開發高通量藥物毒性篩查設備，也有意從事藥物開發方面的工作。羅馬真的一天就可以建成Kolonin 是 n3D Biosciences 公司的客戶之一，他主要使用這項技術對脂肪組織開展研究，同時他也認為這項技術比較適合進行幹細胞組織培養方面的工作。如果要在體外（培養皿中）再造一個組織，那麼就需要提供組織中存在的所有類型的細胞，而且要讓這些細胞彼此之間建立聯繫。可是在實驗室里常用的扁平培養皿中，通常只能生長一種細胞，因為只有最適於在塑料表面和某種特定培養基環境中生存的細胞才能勝出，其它細胞都會慢慢死去。可是使用 n3D Biosciences 公司的培養板就不一樣了。據 Kolonin 介紹，頭一天晚上你把磁珠丟到細胞培養板里，第二天再把培養板放到磁場中，第三天你就會驚奇地發現長出了球狀細胞團塊（spheroid），這種細胞團塊里就含有各種組織細胞。整個過程真的就需要一天時間。Kolonin 還補充說，這種磁場細胞懸浮培養方法非常適合脂肪組織的生長，也很適合幹細胞的培養，用這種方法能夠很好地保持幹細胞的分化能力。不過這些納米磁珠也有可能會對含有磁珠的細胞帶來不好的影響，但那是比較罕見的情況，在培養的細胞中只有少部分細胞會受到影響。而且細胞組織微塊會緊密地團結在一起，保持團塊狀結構，含有磁珠的細胞也會“吐出”磁珠，這些磁珠又會進入到培養基中，繼續發揮作用。美國布朗大學（Brown University in Providence, RhodeIsland）的生物工程師 Jeffrey Morgan 評價道：“我們對細胞三維培養這項技術反應太遲鈍了，不過我相信大家很快就會接受這款新產品，並且對其做出中肯的評價。” Morgan 認為，細胞彼此接觸之後就會彼此發生相互作用，並且進行信息傳遞，這一點是人工生長支架無法提供，也無法滿足的，所以使用這種懸浮培養技術可以讓細胞在更接近體內真實狀態下的環境中生長，尤其適於培養肝臟和心臟這種細胞密度比較大的實體器官。Morgan 也開發了一款細胞三維培養皿，並且於 2009 年在布朗大學所在地普羅維登斯（Providence）成立了他自己的 Microtissues 公司。他們去年與 Sigma-Aldrich 公司達成了合作協議，由 Sigma-Aldrich 公司負責這款產品的銷售工作。 Morgan 的客戶主要也是大學的實驗室和開展藥物毒性篩查工作的製藥企業，以及從事細胞治療相關業務，比如培養移植用細胞組織團塊的生物公司。據 Morgan 介紹，他們之所以想到開發這款三維細胞培養皿，是因為 Morgan 當初與他的研究生 Anthony Napolitano 想在實驗室里用細胞培養出多細胞的球形細胞團塊。他們當時需要一種細胞不能夠貼附的培養材料，可這一點恰恰是傳統細胞培養器材無法滿足的。而且他們還希望這種培養材料不要破壞細胞之間微弱的粘附力，因為細胞就是依靠這種相互作用粘附在一起的。最終他們的目光鎖定在了瓊脂糖（agarose）上。瓊脂糖主要被用作合成水凝膠（hydrogel），我們知道水凝膠里98%都是水，所以 Morgan 在介紹他們的工作時會開玩笑地說道：“我們是在進行水‘雕’。”有人曾經將融化的瓊脂糖製成微型培養板（micro-moulds），等瓊脂糖凝固之後，再將這種瓊脂糖材料放置到普通的培養板里。再在培養板里加入細胞和培養基，由於重力的作用，細胞會沉積到瓊脂糖培養板里，彼此聚集在一起，形成球形的多細胞團塊。這種瓊脂糖培養板經過高壓滅菌處理之後還可以重新再利用。據 Morgan 介紹，這種微型培養板培養出來的球形細胞團塊外形都比較均一，可以通過控制接種細胞的數量來控制球形細胞團塊的大小。而且和使用生長支架的方式相比，使用這種方法培養的細胞更加容易收集，只需要將培養板倒過來就可以倒出細胞，非常方便。美國得克薩斯大學（UniversityofTexas）的Mikhail Kolonin (圖左)和AlexesDaquinag（圖右）正在從事脂肪組織與幹細胞方面的研究工作。更廣闊的應用前景Primorigen 公司的 CEO Chuck Oehler 認為，雖然幹細胞研究和細胞培養技術的發展日新月異，但是我們現在離細胞治療還有相當長的一段距離。不過包括他們公司在內的諸多生物技術公司還是經常會接到幹細胞治療的要求。不過這可不是幹細胞研究者希望看到的局面。有一位身患糖尿病的科研人員注射了 30 多年的胰島素。幾年前他接受了胰島 β 細胞移植手術，手術后他有將近 1 年的時間沒有注射胰島素，同時他的病情也有所緩解，比如手指和腳趾的麻木感有所減輕。“從我自己的切身經歷就可以發現，細胞治療技術擁有非常廣闊的應用前景，只要我們這些科研人員能夠生產出足夠的、有活性的細胞。通過這次手術，我也真實地體會到了再生醫學（regenerative medicine）對我自己，和我家人的生活質量帶來了多麼大的影響和改變。所以對於那些不了解我們這一行情況的患者和醫護人員對我們的工作進展得如此緩慢表示出的不耐煩和焦急的心情，我也非常理解。”這位科研人員這樣說道。作為第一批吃螃蟹的人，他真實地體會到了細胞培養技術的現實意義。原文檢索：Vivien Marx. Cell culture: A better brew. Nature, 11 April 2013; doi:10.1038/496253a