在一般的熒光現象中，由於激發光的光子密度低，一個熒光分子只能同時吸收一個光子，再通過輻射躍遷發射一個熒光光子，這就是單光子熒光。對於以激光為光源的熒光激發過程，則可能產生雙光子甚至多光子熒光現象，這時所用的激發光源強度高，光子密度滿足熒光分子同時吸收兩個光子的要求。以一般的激光為激發光源的過程中，光子密度仍然不足以產生雙光子吸收現象，通常採用飛秒脈衝激光器，其瞬時功率可以達到兆瓦量級。因此，雙光子熒光的波長比激發光的波長短，相當於半激發波長激發產生的效果。
優點
與共焦熒光顯微鏡相比，雙光子熒光顯微鏡具有以下優點：
1.長波長的
光比短波長的光受散射影響較小，容易穿透標本；
2.焦平面外的熒光分子不被激發，使較多的激發光可以到達焦平面，並且
激發光可以穿透更深的標本；
3.長波處的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；
4.使用雙光子熒光顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。