曲頸瓶實驗

為了回答這些挑戰，巴斯德重做了斯帕蘭扎尼的實驗。他在圓瓶里灌進一些酵母湯，把瓶頸焊封，煮沸幾分鐘后擱置適當時間。結果表明，瓶里並沒有微生物生長。這一試驗並不能徹底駁倒自生論者。

他們坐在巴斯德的書房裡吵吵鬧鬧：“你在煮沸酵母湯時，把瓶里的空氣加熱了。酵母湯產生小動物所需要的是自然的空氣。你不能把酵母湯和天然的未經加熱的空氣放在一起而不產生酵母、黴菌、桿菌或小動物！”

面對對方的指責，巴斯德冥思苦想，決心設計一種只讓天然空氣進入而不許其中的微生物進入的儀器。在老教授巴拉的指導下，巴斯德終於設計、製作出了符合這一要求的儀器，即著名的曲頸瓶。實驗取得了完全的成功。他喜不自勝。在一個有學者、才子、藝術家爭相參加的巴黎盛會上，巴斯德講述了他的曲頸瓶試驗，高聲宣布：“自然發生學說，經過這簡單實驗的致命一擊之後，絕不能再爬起來了”。

接著，巴斯德又創造性地做了一次大規模的、半公開的實驗。他和助手們將煮過的裝有細菌培養液的燒瓶分放在多塵的市區、巴黎天文台的地窖里和其他環境中打開。

發現空氣越是不潔，培養液變質就越快、越嚴重。這說明使培養液變質的細菌不是自生的，而是來自空氣。他推測，海拔越高，空氣一定越潔凈，培養液受細菌的污染也越輕微。為了驗證這一點，他和助手們又先後登上汝拉山區的浦佩山，爬上瑞士的勃朗峰，進行實驗。結果，猜想得到了證實。

巴斯德向科學界報告了自己的實驗結果。許多聽眾無不為他們的冒險獻身所感動，為他們的證據所折服。可是堅持自然發生說的反對派仍繼續起勁地譴責巴斯德，稱他是“馬戲團的演員、騙子和小丑”。攻擊得特別凶的是博物學家布歇（Pouch-et，一譯浦舍）等人。他們還採用以巴斯德之矛攻巴斯德之盾的辦法，在一些瓶子里灌進乾草浸液而不是酵母湯，並造成真空，趕往比利牛斯山脈的高山瑪拉得塔，登上了比勃朗峰還要高出幾英尺的山巔，打開瓶口。由於他們採用的是乾草浸液，加之沒有加熱，結果在瓶中發現了微生物。藉此，布歇攻擊巴斯德是“以自己的瓶子作為對科學的最後通牒而驚世駭人”，要求在科學院作公開試驗，而且說，如果他們的瓶子有一個打開之後而不立刻生長微生物的話，他們願意承認錯誤。

公開試驗那天，巴斯德應戰準時在科學院委員會做了試驗。可是布歇等卻嚇得沒敢到場。於是委員會作出了贊同巴斯德意見的決定。

義大利醫生雷地於1668年進行的實驗以及其他一些科學家的反覆驗證，曾一度動搖了人們對自然發生論的信念。可是當後來發現了微生物時，很多科學家又相信至少像微生物這樣“最小的”生物體總該是自生的。加罩容器中的腐肉不是長滿了細菌嗎！於是，微生物可能自然發生的信念又盛行起來。

巴斯德根據自己的研究實踐，不相信微生物可以自然發生，認為微生物肯定必有母體。他到處宣傳這一理論。這下子可激怒了自生論者。他們問巴斯德：“酵母怎在地球的每一個角落裡，在每一世紀的每一年裡，不知道從什麼地方出現，把葡萄汁釀成酒？這些從天南地北，處處把每個罐里的牛奶變酸，每瓶里的牛油變壞的小動物，來自什麼地方？”