內切酶

endonuclease

這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同於一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序 ——識別順序。長期以來，難以深入研究的DNA大分子，藉此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發現，為基因結構、DNA鹼基順序分析和基因工程的研究開闢了途徑。為此，W.阿爾伯，H.史密斯和D.內森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾生理學或醫學獎。

內切酶主要分成三大類。

第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，無法用於分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。

第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序，並在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由於這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，並能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分佈是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有（3×109/4×103）約106個切點。

第二類內切酶的識別順序是一個迴文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：

↓ |

5’……GAA | TTC……3’

3’……CTT | AAG……5’

| ↑

垂直虛線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是迴文順序（palindrome）。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割後生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，可通過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如HaeⅢ的識別位置是：

↓

5’……GG↓CC……3’

3’……CC↓GG……’

↑

在箭頭所指處切割，產生的兩個DNA片段是：

5’……GG CC……3’

和

3’……CC GG……5’

有時候兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在於當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。

第三類內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的迴文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對於克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。

克隆PCR產物的方法之一，是在PCR產物兩端設計一定的限制酶切位點，經酶切后克隆至用相同酶切的載體中。但實驗證明，大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護鹼基，才能使所定的限制酶對其識別位點進行有效切斷。

酶切位點（內切酶的識別序列）要加在引物的5'端，為保證PCR產物能被限制性內切酶的識別且有效的酶切，一般在引物的5'端酶切位點側邊加上保護鹼基。

具體為：5'-保護鹼基+酶切位點+引物序列-3'

用來識別特定的脫氧核苷酸序列，並對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶。

一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株（品系）。例如，從Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性內切酶稱為Bam H，在同一品系細菌中得到的識別不同鹼基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等。

別名：restriction endonuclease簡稱限制酶

酶反應：限制性內切酶能分裂DNA分子在一限定數目的專一部位上。它能識別外源DNA並將其降解。

單位定義：在指明pH與37℃，在0.05mL反應混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。

性狀製品不含非專一的核酸水解酶（由10單位內切酶與1μg λDNA，保溫16小時所得的凝膠電泳圖譜的穩定性表示），這類酶主要是從原核生物中分離出來的，迄今已經從近300多種不同的微生物中分離出約4000種限制酶。

根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬於I類酶。其分子量較大；反應過程中除需Mg外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。因此，I類酶作為DNA的分析工具價值不大。Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小於105道爾頓；反應只需Mg；最重要的是在所識別的特定鹼基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用后，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。

限制性內切酶識別DNA序列中的迴文序列。有些酶的切割位點在迴文的一側（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在迴文序列中間，形成平整末端。Alu I的切割位點如下：

5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5'

在已發現的限制性內切酶中，近百種酶的識別順序已被測定。有很多來源不同的酶有相同的鹼基識別順序，這種酶稱為“異源同功酶”（isochizomer，同切限制內切酶；同裂酶）。應該注意的是，這些酶雖然有相同的識別順序，但它們的切點並不完全一樣。例如Xma I和Sma I都識別六核苷酸CCCGGG，但Xma I的切點在CCCCGGG，而Ema I的切點則在CCCGGGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG粘性末端的DNA片段，而後者並不形成粘性末端（而叫平末端）。當然，也有識別順序和切點都相同的酶，如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、Mno I，都在識別順序CCGG內有一相同的切點，Hal Ⅲ和BsuR I同樣在識別順序GGCC內有一相同的切點。

限制性核酸內切酶分佈極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發現至少一種限制性內切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現已發現的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，酶含量極高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高產酶菌株。據報道從10g的H. aegyptius的細胞中，能分離提純出可消化l0gλ噬菌體DNA的酶量。細菌是限制性內切酶，尤其是特異性非常強的I類限制性內切酶的主要來源。

限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例：

根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。

第一型限制酶

同時具有修飾（modification）及識別切割（restriction）的作用；另有識別（recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距離識別位（recognition site）可達數千個鹼基之遠。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶

只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的迴文序列（palindrome sequence）；所剪切的鹼基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindⅢ。

第三型限制酶

與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24-26個鹼基對。例如：HinfⅢ。

限制作用實際就是限制酶降解外源DNA ，維護宿主遺傳穩定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。所以，能產生防禦病毒侵染的限制酶的細菌，其自身的基因組中可能有該酶識別的序列，只是該識別序列或酶切位點被甲基化了。但並不是說一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數限制酶對DNA甲基化敏感，因此當限制酶目標序列與甲基化位點重疊時，對酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對甲基化DNA的切割能力是限制酶內在和不可預測的特性，因此，為有效的切割DNA，必須同時考慮DNA甲基化和限制酶對該類型甲基化的敏感性。另外，大部分商業限制酶如今專門用於切割甲基化DNA。