基因克隆

基因是細胞內DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。基因控制蛋白質合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現出不同的性狀的根本原因，即所謂"種瓜得瓜，種豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通過DNA複製及細胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，並通過控制蛋白質的合成使遺傳信息得到表達。

“分”是指分離製備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA。"切"是指用序列特異的限制性內切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；"連"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉"是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行複製和擴增；"選"則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。基因工程技術的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行"外科手術"。

基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人於1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，於是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。

一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主複製能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。

採用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。

基因克隆技術的想法第一次出現在1972年11月在檀香山的一個有關質粒的科學會議上。（質粒是在細菌中發現的DNA環。質粒攜帶某些對抗生素的耐藥性的基因。）一直在研究質粒的史坦利·科恩，對赫伯特·博耶網站上的關於細菌酶切割DNA分子中的特定部分的介紹很感興趣。在一個深夜遊覽威基基的一間熟食店兩位科學家相遇並談到將合作領域的科學知識相結合，構思出了一個開創現代生物技術產業的實驗。到1973年初，他們推出了一系列的實驗，得到方法來選擇特定的外源基因在細菌中複製。

DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我複製的載體DNA連接，然後將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。

目的DNA片段的獲得

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自於目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。由於基因組DNA較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。

載體的選擇

基因工程的載體應具有一些基本的性質：1）在宿主細胞中有獨立的複製和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。2）分子量儘可能小，以利於在宿主細胞中有較多的拷貝，便於結合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特徵（如對抗生素的抗性）。4）載體本身最好具有儘可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇範圍。若載體上的單一酶切位點是位於檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利於重組子的篩選。

DNA克隆常用的載體有：質粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。

體外重組

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連接，此為修飾黏末端連接。

導入受體細胞

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

將外源重組DNA分子導入原核宿主細胞的方法有轉化（transformation），轉染（transfection），轉導（transduction）。重組質粒通過轉化技術可以導入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉染技術導入。轉染效率不高，因此將重組噬菌體 DNA或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，藉助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的導入效率要比轉染的導入效率高。

重組子的篩選

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：

（一）插入失活法

外源DNA片段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。

（二）PCR篩選和限制酶酶切法

提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（三）核酸分子雜交法

製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段，或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（四）免疫學篩選法

獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。

上述方法獲得的陽性克隆最後要進行測序分析，以最終確認目的基因。