CLEIA常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應在鹼性緩衝液中進行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩衝液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發發光，而在最後光強度測定中造成空白乾擾，因而宜分別配製成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。
HRP催化魯米諾氧化的反應可被某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶等加強。加強劑的作用是增強發光和延長發光時間，由此可提高敏感度。
在以AP為標記酶的化學發光酶免疫測定中，應用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如
PPD可供應用。發光反應的反應式如下：