雙酶切

1、同步雙酶切

同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩衝液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內切酶在不同緩衝液中的活性見《內切酶在不同緩衝液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩衝液即可用於雙酶切。由於內切酶在非最佳緩衝液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可根據每種酶在非最優緩衝液中的具體活性相應調整酶量和反應時間。

2、分步酶切

如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩衝液，就只能採用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然後加入第二種酶完成雙酶切反應。

3、使用配有特殊緩衝液的酶進行雙酶切（圖）

使用配有特殊緩衝液的酶進行雙酶切也不複雜。在大多數情況下，採用標準緩衝液的酶也能在這些特殊緩衝液中進行酶切。這保證了對緩衝液有特殊要求的酶也能良好工作。由於內切酶在非最佳緩衝液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。通過《內切酶在不同緩衝液里的活性表》可查看第二種酶在特殊緩衝液相應鹽濃度下的作用活性。

雙酶切建議緩衝液

註：

只要其中一種酶需要添加BSA，則應在雙酶切反應體系中加入BSA。BSA不會影響任何內切酶的活性。

注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現星號活性，詳見《星號活性》。可通過增加反應體系的總體積的方法實現這一要求。

某些內切酶的組合不能採用同步雙酶切法，只能採用分步法進行雙酶切。上表中這些組合以“seq”標註。

1、回收PCR產物：

在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護鹼基。

雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，我一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。

純化問題：純化PCR產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是TAKARA的純化柱試劑盒

酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，37℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15μg的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的 DNA約為3μg，而PCR純化后的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 質量好，酶切完全切得動。

2、酶切、回收后的PCR產物與載體的連接

摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。回收的載體片段：回收的PCR產物片段=1：3到1：10　，一般取前者0.03pmol，後者取0.3pmol。

pmol為單位的DNA轉換為為μg單位的DNA：（X pmoles×長度bp×650）/ 1，000，000 （註：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為μg，也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如載體是5380bp，則0.03pmol為

0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

測DNA濃度測定可使用微量可見光分光光度計或者可以使用艾本德的 BioPhotometer核酸蛋白分析儀，注意OD值，一般約1.7-1.9.的 說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應體系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應30分鐘時，有90%以上的DNa段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl ，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。

3、轉化：

a、一般轉化僅需要加入2 μl加入至100 μl 正常的TOP10感受態細胞中，冰浴放置30分鐘。

b、再在水浴中42℃熱激一般90～120秒鐘后，再在冰中放置3分鐘。

c、加入800 μl 無抗生素培養基，37℃全溫振蕩搖床培養40分鐘。

取100μl塗布平板。一般轉化質粒不建議離心塗布（除非感受態效價特別低），

幾個非常重要的問題

1 做轉化質粒的時候一般不加連接酶。對PCR產物進行酶連接反應時，注意保持低溫狀態，因為T4連接酶長時間放置在常溫下容易活性降低，建議在冰盒中操作。

2 對含有AMP-RESISTENCE的質粒塗布時，一般培養基會放置在培養箱中一段時間后才會到感受態中，

3對照的設立：

為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照：

A 酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線性。如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.

做轉化時，也要進行對照.　設4個：

A.即拿雙酶切的質粒產物也進行連接反應，這個對照可進一步看雙酶切是否成功，如果長出克隆，說明很有可能只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切成功，當然要保證感受態，培基，連接酶都'正常'的情況下.

B.酶切過的未進行連接反應的雙酶切產物，進行轉化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒

C.設原始質粒為對照，意為檢測整個操作過程中是否有誤.

D.AMP陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠，檢測感受態狀況.

4.所有的試劑切記低溫保存。一步一個腳印。不要偷懶，圖省事最後卻更費事。注意設立對照。

經PCR鑒定，克隆90%-100%的陽性率，所以在後面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。然後雙酶切鑒定，測序。

1、做轉化的時候，進行酶連接反應時，注意保持低溫狀態，因為LIGASE酶很容易降解。為保險起見，一般連接3小時，16度。

2、對含有AMP-RESISTENCE的質粒鋪板時，注意加AMP時的溫度，溫度過高，會使克隆株無法篩選出來。我的方法是培基高溫消毒後放在烤箱里，烤箱一般溫度為55-60度，然後做的時候拿出來，這樣好掌握溫度。鋪板前後注意用吹風機吹乾。

3、對照的設立：為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照：

酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線性。如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功。做轉化時，也要進行對照。