雙光子顯微鏡

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈衝激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈衝寬度只有 100 飛秒，而其頻率可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈衝激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。

雙光子熒光顯微鏡有很多優點：

1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；

2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；

3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；

4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來觀察厚標本、更適合用來觀察活細胞、或用來進行定點光漂白實驗。

配備固定載物台的雙光子顯微鏡能提供最佳的機械穩定性，將電雜訊干擾減至最低，可以說是專為活體標本及電生理而設。而可遠程操控的2孔切換物鏡轉盤能實現無振動切換避免給複雜高穩定要求的實驗帶來干擾。物鏡帶防腐蝕陶瓷表面，以及延展至紅外範圍的色差校正，是同時進行多光子成像以及電生理數據記錄的理想工具。

一些配備前置補償的飛秒級激光器和OPO激光器的雙光子顯微鏡，所有紅外激光器的操控，包括前置補償單元的微調等，都能由徠卡軟體完成。有了OPO激光器之後，紅色和綠色熒光都能同時被激發了，從而達到更好更清晰的記錄效果。