瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

瓊脂糖凝膠具有網路結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決於凈電荷的性質和數量，而且還取決於分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由於其孔徑相比於蛋白質太大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用於核酸的研究中。

蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。電泳緩衝液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低，但它製備容易，分離範圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb，利用脈衝電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

準備乾淨的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現象。

電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要解析度高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯醯胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈衝凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。

凝膠濃度

對於瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現象。

常用的緩衝液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩衝能力。電泳時使用新制的緩衝液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩衝液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩衝性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

電壓和溫度

電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低於30℃，對於巨大的DNA電泳，溫度應該低於15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象

DNA樣品的純度和狀態

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉澱可以去除多餘的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩衝液稀釋可以防止DNA變性。

DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規則或條帶信號弱等現象。

凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發波長，如果激發波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。

DNA片段的膠回收方法

電泳洗脫法

低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法

凍融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法

膠回收注意事項

將電泳槽用ddH2O反覆清洗乾淨，倒入新鮮配製的滅菌電泳緩衝液；

根據點樣量製備合適厚度的瓊脂糖凝膠板；

切膠時儘可能切掉不含DNA片段的凝膠；

要盡量減少DNA在紫外下的照射時間以減少對DNA的損傷；

熔膠要完全。

切膠時還要注意手臂不要有裸露皮膚，以防被紫外線直接照射，如果有條件的話還可以戴一副防護眼鏡，減少對眼睛的傷害。