分子克隆實驗指南

分子克隆技術30多年來一直是全球生命科學領域實驗室專業技術的基礎。冷泉港實驗室出版社出版的《分子克隆實驗指南》一書擁有的可靠性和權威性，適用於對所有分子生物學技術實驗有需要的研究人員。

第四版的《分子克隆實驗指南》保留了之前版本中備受讚譽的細節和準確性，10個原有的核心章節經過更新，反映了標準技術的發展和創新，並介紹了一些前沿的操作步驟。同時還修訂了第三版中的核心章節，以突出現有的核酸製備和克隆、基因轉移及表達分析的策略和方法，並增加了12個新章節，專門介紹最激動人心的研究策略，包括利用DNA甲基化技術和染色質免疫沉澱的表觀遺傳學分析、RNAi、新一代測序技術，以及如何處理數據生成和分析的生物信息學，例如介紹了分析工具的使用，如何比較基因和蛋白質的序列，鑒定多個基因的常見表達模式等。本書還保留了必不可少的附錄，包括試劑和緩衝液、常用技術、檢測系統、一般安全原則和危險材料。

譯者序

第四版前言

上冊

第1章 DNA的分離及定量 1

導言 2

方案1 SDS鹼裂解法製備質粒DNA：少量製備 9

方案2 SDS鹼裂解法製備質粒DNA：大量製備 12

方案3 從革蘭氏陰性菌（如Ecolz中分離DNA 15

方案4 乙醇法沉澱DNA 17

方案5 異丙醇法沉澱DNA 21

方案6 用微量濃縮機進行核酸的濃縮和脫鹽 22

方案7 丁醇抽提法濃縮核酸 23

方案8 聚乙二醇沉澱法製備Ml3噬菌體單鏈DNA 24

方案9 Ml3噬菌體鋪平板 27

方案10 Ml3噬菌體液體培養 30

方案11 Ml3噬菌體雙鏈（複製型）DNA的製備 32

方案12 利用有機溶劑分離純化高分子質量DNA 35

方案13 用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子質量DNA 37

方案14 一步法同時提取細胞或組織中的DNA、RNA和蛋白質 43

方案15 從鼠尾或其他小樣本中製備基因組DNA 46

替代方案：不使用有機溶劑從鼠尾分離DNA 48

替代方案：一管法從鼠尾中分離DNA 49

方案16 快速分離酵母DNA 50

方案17 微型凝膠電泳后使用溴化乙錠(EB)估算條帶中DNA數量 52

方案18 利用Hoechst33258通過熒光分析儀估算DNA濃度 53

方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55

信息欄 56

第2章 DNA分析 62

導言 63

方案1 瓊脂糖凝膠電泳 73

方案2 瓊脂糖凝膠中DNA的染色檢測 76

方案3 聚丙烯醯胺凝膠電泳 80

方案4 聚丙烯醯胺凝膠中DNA的染色檢測 85

方案5 聚丙烯醯胺凝膠中DNA的放射自顯影檢測 86

方案6 鹼性瓊脂糖凝膠電泳 87

附加方案：鹼性瓊脂糖凝膠的放射自顯影 90

方案7 成像：放射自顯影和感光成像 91

方案8 用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA 96

方案9 低熔點瓊脂糖凝膠中DNA的回收：有機溶劑抽提法 98

方案10 聚丙烯醯胺凝膠中DNA片段的回收：壓碎與浸泡法 101

方案11 Southern印跡 103

方案12 Southern印跡：DNA從一塊瓊脂糖凝膠同時向兩張膜轉移 110

方案13 採用放射性標記探針對固定在膜上的核酸DNA進行Southern雜交 112

附加方案：從膜上洗脫探針 117

信息欄 119

第3章 質粒載體克隆與轉化 122

導言 123

方案1 製備和轉化感受態大腸桿菌的Hanahan方法：高效轉化策略 126

方案2 製備和轉化感受態大腸桿菌的Inoue方法：“超級感受態”細胞 131

方案3 大腸桿菌的簡單轉化：納米顆粒介導的轉化 135

替代方案：一步法製備感受態大腸桿菌：在同一溶液中轉化和儲存細菌細胞 136

方案4 電穿7L法轉化大腸桿菌 138

方案5 質粒載體克隆：定向克隆 143

方案6 質粒載體克隆：平末端克隆 145

方案7 質粒DNA的去磷酸化 148

方案8 向平末端DNA添加磷酸化銜接子/接頭 150

方案9 克隆PCR產物：向擴增DNA的末端添加限制性酶切位點 151

方案10 克隆PCR產物：平末端克隆 154

方案11 克隆PCR產物：制各T載體 157

方案12 克隆PCR產物：TA克隆 159

方案13 克隆PCR產物：TOPO TA克隆 161

方案14 使用X-Gal和IPTG篩選細菌菌落：a-互補 165

信息欄 167

第4章 Gateway重組克隆 205

導言 206

方案1 擴增Gatewav載體 210

方案2 製備可讀框入門克隆和目的克隆 213

方案3 應用多位點LR克隆反應製備目的克隆 219

信息欄 222

第5章 細菌人工染色體及其他高容量載體的應用 223

導言 224

方案1 BAC DNA的小量分離和PCR檢驗 235

方案2 BAC DNA的大量製備和線性化 238

方案3 通過脈衝電場凝膠電泳檢驗BAC DNA的質量和數量 241

方案4 兩步BAC工程：穿梭載體DNA的製備 242

方案5 A同源臂(A-Box)和B同源臂(B-Box)的製備 244

方案6 克隆A和B同源臂到穿梭載體 247

方案7 重組穿梭載體的製備和檢驗 249

方案8 通過電穿7L法轉化重組穿梭載體到感受態BAC宿主細胞 251

方案9 共合體的檢驗和重組BAC克隆的篩選 253

方案10 一步BAC修飾：質粒製備 256

方案11 A同源臂(A-Box)的製備 259

方案12 克隆A同源臂到報道穿梭載體 260

方案13 用RecA載體轉化BAC宿主 263

方案14 轉移報道載體到BACiRecA細胞以及共合體的篩選 265

方案15 釀酒酵母(S.cerevisiae)的生長和DNA製備 267

方案16 酵母DNA的小量製備 269

信息欄 270

第6章 真核細胞RNA的提取、純化和分析 275

導言 276

方案1 從哺乳動物的細胞和組織中提取總RNA 279

替代方案 從小量樣本提取RNA 281

方案2 從斑馬魚胚胎和成體中提取總RNA 282

方案3 從黑腹果蠅提取總RNA 283

方案4 從秀麗隱桿線蟲中提取總RNA 285

方案5 從釀酒酵母菌中採用熱酸酚提取總RNA 287

方案6 RNA定量和儲存 289

方案7 RNA的乙醇沉澱 295

方案8 通過無RNase的DNaseI處理去除RNA樣品中的DNA污染 297

方案9 oligo(dT)磁珠法提取poly(A)+mRNA 298

方案10 按照大小分離RNA：含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 308

方案11 根據分子質量大小分離RNA: RNA的尿素變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 312

方案12 瓊脂糖凝膠中變性RNA的轄膜和固定 319

替代方案 下行毛細管轉移 323

方案13 聚丙烯醯胺凝膠的電轉移和膜固定 325

方案14 Northern雜交 327

方案15 純化RNA的點雜交和狹縫雜交 330

方案16 用核酸酶Sl對RNA作圖 342

方案17 核糖核酸酶保護分析：用核糖核酸酶和放射性標記的RNA探針對RNA作圖 349

方案18 引物延伸法分析RNA 355

信息欄 359

第7章 聚合酶鏈反應 363

導言 364

方案1 基礎PCR 375

方案2 熱啟動PCR 380

方案3 降落PCR 383

方案4 高GC含量模板的PCR擴增 385

方案5 長片段高保真PCR (IA PCR) 390

方案6 反向PCR 393

方案7 巢式PCR 397

方案8 mRNA反轉錄產物cDNA的擴增：兩步法RT-PCR 400

方案9 由mRNA的5'端進行序列的快速擴增：5'-RACE 409

方案10 由mRNA的3'端進行序列的快速擴增：3 '-RACE 416

方案11 使用PCR篩選克隆 422

信息欄 424

第8章 生物信息學 431

導言 432

方案1 使用ucsc基因組瀏覽器將基因組註釋可視化 434

方案2 使用BLAST和ClustalW進行序列比對和同源性檢索 444

方案3 使用Primer3Plus設計PCR引物 450

方案4 使用微陣列和RNA-seq進行表達序列譜分析 461

方案5 將上億短讀段定位至參考基因組上 472

方案6 識別ChIP-seq數據集中富集的區域（尋峰） 483

方案7 發現順式調控基序 495

信息欄 503

中冊

第9章 實時熒光聚合酶鏈反應定量檢測DNA及RNA 509

導言 510

方案1 實時PCR反應用引物和探針濃度的優化 532

方案2 製作標準曲線 537

方案3 實時熒光PCR定量檢測DNA 540

方案4 實時熒光PCR定量檢測RNA 542

方案5 實時熒光PCR實驗數據的分析和歸一化 545

信息欄 550

第10章 核酸平台技術 551

導言 552

方案1 即制微陣列 560

方案2 Round AiRoundB DNA擴增 564

方案3 核小體DNA和其他小於500bp的DNA的T7線性擴增(TIAD) 567

方案4 RNA的擴增 572

方案5 RNA的Cvanine-dUTP直接標記 578

方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP間接標記 581

方案7 用Klenow酶對DNA進行Cyanine-dCTP標記 583

方案8 DNA的間接標記 585

方案9 封閉自製微陣列上的多聚賴氨酸 587

方案10 自製微陣列的雜交 589

第11章 DNA測序 595

導言 596

方案1 毛細管測序質粒亞克隆的製備 620

方案2 毛細管測序之PCR產物的製備 625

方案3 循環測序反應 627

方案4 全基因組：手工文庫製備 630

方案5 全基因組：自動化的無索引文庫製備 636

附加方案 自動化的文庫製備 642

方案6 全基因組：自動化的帶索引文庫製備 644

方案7 用於Illumina測序的3kb末端配對文庫的製備 651

方案8 用於Illumina測序的8kb末端配對文庫的製備 659

附加方案 AMPure磁珠校準 671

方案9 RNA—Seq:RNA反轉錄為cDNA及其擴增 673

附加方案 RNACleanⅪ’磁珠純化/RNA—Seq前） 679

方案10 液相外顯子組捕獲 680

附加方案 AMPure XP磁珠純化 688

附加方案 瓊脂糖凝膠大小篩選 689

方案11 自動化大小篩選 690

方案12 用SYBR Green-qPCR進行文庫定量 693

方案13 用PicoGreen熒光法進行文庫DNA定量 696

方案14 文庫定量：用Qubit系統對雙鏈或單鏈DNA進行熒光定量 700

方案15 為454測序製備小片段文庫 702

方案16 單鏈DNA文庫的捕獲及emPCR 708

方案17 Rochei454測序：執行一個測序運行 714

方案18 結果有效性確認 721

方案19 測序數據的履量評估 723

方案20 數據分析 724

信息欄 725

第12章 哺乳動物細胞中DNA甲基化分析 729

導言 730

方案1 DNA亞硫酸氫鹽測序法檢測單個核苷酸的甲基化 735

方案2 甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測特定基因的DNA甲基化 742

方案3 基於甲基化胞嘧啶免疫沉澱技術的DNA甲基化分析 745

方案4 高通量深度測序法繪製哺乳動物細胞DNA甲基化圖譜 749

方案5 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Roche454克隆測序 760

方案6 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Illumina測序 765

信息欄 770

第13章 標記的DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針的製備 775

導言 776

方案1 隨機引物法：用隨機寡核苷酸延伸法標記純化的DNA片段 792

方案2 隨機引物法：在融化瓊脂糖存在下用隨機寡核苷酸延伸法標記DNA 798

方案3 用切口平移法標記DNA探針 800

方案4 用聚合酶鏈反應標記DNA探針 804

附加方案 不對稱探針 808

方案5 體外轉錄合成單鏈RNA探針 809

附加方案 用PCR法將噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動子加至DNA片段上 816

方案6 用隨機寡核苷酸引物法從mRNA合成cDNA探針 818

方案7 用隨機寡核苷酸延伸法製備放射性標記的消減cDNA探針 820

方案8 用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段標記雙鏈DNA的3' 端 825

方案9 用鹼性磷酸酶進行DNA片段的去磷酸化 831

方案10 含5'突出羥基端的DNA分子磷酸化 833

方案11 去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化 836

方案12 用T4多核苷酸激酶進行寡核苷酸5'端的磷酸化 839

方案13 用末端脫氧核苷酸轉移酶標記寡核苷酸3'端 841

替代方案 用TdT合成非放射性標記的探針 843

附加方案 加尾反應 843

附加方案 合成非放射性標記探針的修飾 844

方案14 用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段標記合成的寡核苷酸 845

方案15 用乙醇沉澱法純化標記的寡核苷酸 849

方案16 用空間排阻層析法純化標記的寡核苷酸 850

方案17 用Sep-PakCl8柱色譜法純化標記的寡核苷酸 852

方案18 寡核苷酸探針在水溶液中雜交：在含季銨鹽緩衝液中洗滌 854

信息欄 857

第14章 體外誘變方法 871

尋言 872

方案1 用易錯DNA聚合酶進行隨機誘變 879

方案2 重疊延伸PCR產生插入或缺失誘變 890

方案3 以雙鏈DNA為模板的體外誘變：用DpnI選擇突變體 897

方案4 突變型B一內醯胺酶選擇法定點誘變 904

方案5 通過單一限制性位點消除進行寡核苷酸指導的誘變/USE誘變） 910

方案6 利用密碼子盒插入進行飽和誘變 915

方案7 隨機掃描誘變 922

方案8 多位點定向誘變 926

方案9 基於PCR的大引物誘變 930

信息欄 933

第15章 向培養的哺乳動物細胞中導入基因 937

導言 938

方案1 陽離子脂質試劑介導的DNA轉染 942

替代方案 採用DOTMA和DOGS進行轉染 948

附加方案 單層細胞組織化學染色檢測B一半乳糖苷酶 950

方案2 磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞 952

替代方案 磷酸鈣介導的質粒DNA高效轉染真核細胞 956

方案3 磷酸鈣介導的高分子質量基因組DNA轉染細胞 959

替代方案 磷酸鈣介導的貼壁細胞的轉染 962

替代方案 磷酸鈣介導的懸浮生長細胞的轉染 963

方案4 DEAE-葡聚糖介導的轉染：高效率的轉染方法 964

替代方案 DEAE-葡聚糖介導的轉染：提高細胞活力的方案 966

方案5 電穿孑L轉染DNA 968

方案6 通過alamarBlue法分析細胞活力 972

方案7 通過乳酸脫氫酶法分析細胞活力 974

方案8 通過MTT法分析細胞活力 977

信息欄 980

第16章 向哺乳動物細胞中導入基因：病毒載體 998

導言 999

方案1 直接克隆法構建重組腺病毒基因組 1 019

方案2 將克隆的重組腺病毒基因組釋放用於挽救和擴增 1023

方案3 氯化銫梯度沉降法純化重組腺病毒 1028

方案4 限制性內切核酸酶消化法鑒定純化后的重組腺病毒基因組 1031

方案5 TCID50終點稀釋結合qPCR測定重組腺病毒感染滴度 1034

附加方案 準備qPCR的DNA標準品 1042

方案6 濃縮傳代和Real-Time qPCR法檢測有複製能力腺病毒(RCA) 1043

方案7 瞬時轉染法製備rAAV 1051

方案8 氯化銫梯度沉降法純化rAAV 1054

方案9 碘克沙醇梯度離心法純化rAAV 1059

方案10 肝素親和層析法純化rAAV2 1062

方案11 陰離子交換柱層析法從碘克沙醇梯度離心后的rAAV樣本中富集完全包裝病毒 1065

方案12 實時定量PCR法測定rAAV基因組拷貝數 1068

方案13 TCID50終點稀釋結合qPCR法靈敏測定rAAV惑染滴度 1071

方案14 負染色法和高分辨電子顯微鏡分析rAAV樣本形態 1074

方案15 銀染SDS-PAGE分析rAAV純度 1076

方案16 高滴度反轉錄病毒和慢病毒載體的製備 1079

方案17 慢病毒載體的滴定 1085

方案18 監測慢病毒載體儲備液中的可複製型病毒 1089

信息欄 1091

下冊

第17章 利用報道基因系統分析基因表達調控 1102

導言 1103

方案1 哺乳動物細胞提取物中B一半乳糖苷酶的測定 1112

附加方案 化學發光實驗檢測B一半乳糖苷酶活性 1115

方案2 單螢光素酶報道基因實驗 1118

方案3 雙螢光素酶報道基因實驗 1123

方案4 酶聯免疫吸附試驗定量檢測綠色熒光蛋白 1128

方案5 用四環素調控基因表達建立細胞系 1131

附加方案 有限稀釋法篩選懸浮細胞的穩定克隆 1138

信息欄 1140

第18章 RNA干擾與小RNA分析 1170

導言 1171

方案1 雙鏈siRNA製備 1185

方案2 通過轉染雙鏈siRNA在哺乳動物細胞中進行RNA干擾 1187

方案3 通過轉染雙鏈siRNA在果蠅S2細胞中進行RNA干擾 1190

方案4 體外轉錄法製備dsRNA 1192

方案5 採用dsRNA浸泡果蠅S2細胞進行RNA干擾 1196

方案6 採用dsRNA轉染在果蠅S2細胞中進行RNA干擾 1198

方案7 小RNA的Northern雜交分析 1199

方案8 反轉錄定量PCR分析小RNA 1203

方案9 構建小RNA高通量測序文庫 1206

方案10 抑制miRNA功能的反義寡核苷酸製備 1215

方案11 在哺乳動物細胞中通過反義寡核苷酸抑制miRNA功能 1216

方案12 在果蠅S2細胞中通過反義寡核苷酸抑制miRNA功能 1218

信息欄 1219

第19章 克隆基因的表達以及目的蛋白的純化和分析 1225

導言 1226

方案1 在大腸桿菌中利用可用IPTG誘導的啟動子表達克隆化基因 1249

附加方案 目標蛋白可溶性表達的小量試驗 1255

替代方案 在大腸桿菌中利用阿拉伯糖BAD啟動子表達克隆基因 1260

替代方案 信號肽融合雖白的亞細胞定位 1261

方案2 用桿狀病毒表達系統表達克隆基因 1265

附加方案 噬菌斑測定法確定桿狀病毒原液的滴度 1271

替代方案 用於轉染昆蟲細胞的桿粒DNA製備 1274

方案3用 甲醇誘導啟動子AOX1在畢赤酵母中表達克隆基因 1277

附加方案 酵母培養物的凍存 1287

方案4 用於純化大腸桿菌中表達可溶性蛋白的細胞提取物的製備 1291

附加方案 酵母細胞玻璃珠裂解法 1296

替代方案 溫和的熱誘導的酶裂解法製備大腸桿菌細胞提取物 1298

替代方案 用溶菌酶裂解和凍融法聯用製備大腸桿菌細胞提取物 1300

方案5 採用固化的金屬親和層析純化多聚組氨酸標記的蛋白質 1302

附加方案 Niz+-NTA樹脂的清洗與再生 1309

替代方案 組氨酸標籤蛋白的快速液相色譜純化 1310

方案6 採用谷胱甘肽樹脂以親和層析純化融合蛋白 1314

方案7 包含體中表達蛋白的增溶 1321

方案8 蛋白質的SDS-PAGE 1325

替代方案 用考馬斯亮藍進行SDS-PAGE凝膠染色的各種不同方法 1335

替代方案 用銀鹽進行SDS-PAGE凝膠染色 1336

方案9 蛋白質的免疫印跡分析 1340

方案 10測定蛋白質濃度的方法 1347

信息欄 1353

第20章 利用交聯技術分析染色質結構與功能 1358

導言 1359

方案1 甲醛交聯 1369

方案2 製備用於染色質免疫沉澱的交聯染色質 1371

方案3 染色質免疫沉澱(ChIP) 1373

方案4 染色質免疫沉澱-定量聚合酶鏈反應( ChIP-qPCR) 1377

方案5 染色質免疫沉澱-晶元雜交（ChIP-chip） 1378

方案6 染色質免疫沉澱-高通量測序(ChIP-seq) 1385

方案7 交聯細胞3C文庫的製備 1389

方案8 環形染色質免疫沉澱（ChIP-loop）文庫的製備 1393

方案9 連接產物對照組文庫的製備 1398

方案10 PCR檢測3C、ChIP-loop和對照文庫中的3C連接產物：文庫滴定與相互作用頻率分析 1400

方案11 3C、ChIP-loop和對照組文庫的4C分析 1404

方案12 3C、ChIP-loop和對照組文庫的5C分析 1408

信息欄 1412

第21章 紫外交聯免疫沉澱(CLIP)技術進行體內RNA結合位點作圖 1415

導言 1416

方案1 CLIP實驗免疫沉澱嚴謹性的優化 1424

方案2 活細胞的紫外交聯和裂解物製備 1429

方案3 RNA酶滴定、免疫沉澱及SDS-PAGE 1432

方案4 3'-接頭的連接祁用SDS-PAGE進行大小選擇 1441

替代方案 去磷酸化RL3接頭5端的標記 1445

方案5 RNA標籤的分離、5二接頭的連接和反轉錄PCR擴增 1446

方案6 RNA CLIP標籤測序 1456

方案7 RNA接頭膠回收及保存 1458

信息欄 1460

第22章 Gateway相容酵母單雜交和雙雜交系統 1464

導言 1465

方案1 構建酵母單雜交DNA-誘餌菌株 1474

替代方案 用復性引物從DNA誘餌中獲得入門克隆產物 1481

方案2 生成酵母雙雜交DB-誘餌菌株 1484

方案3 從活化域捕獲文庫中鑒定相互作用分子 1490

方案4 高效的酵母轉化 1496

方案5 用於B-半乳糖苷酶活力的菌落轉移比色測定 1500

方案6 酵母克隆的PCR 1502

信息欄 1504

附錄1 試劑和緩衝液 1507

附錄2 常用技術 1533

附錄3 檢測系統 1541

附錄4 一般安全原則和危險材料 1565

索引 1573