銀染

銀染

銀染是檢測聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質,是銀離子鹼性pH 環境下被還原成金屬銀,沉澱在蛋白質的表面上顯色的原理。銀染的方法種類很多,目前有文獻報道的就有100多種。但是其準確的染色機制還不是特別地清楚。大致的原理是銀離子在鹼性pH 環境下被還原成金屬銀,沉澱在蛋白質的表面上而顯色。由於銀染的靈敏度很高,可染出膠上低於1 ng/蛋白質點,故廣泛的用在2D 凝膠分析上,及極低蛋白含量測定的垂直凝膠中。

應用


主要是用於垂直凝膠電泳中低丰度蛋白的檢測!如內源性GST-Pulldown、Co-IP等實驗中相互作用蛋白的研究。

實驗操作流程


實驗目的:檢測聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質。
實驗原理:在鹼性條件下,用甲醛將蛋白帶上的硝酸銀(銀離子)還原成金屬銀,以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。染色的程度與蛋白中的一些特殊的基團有關,不含或者很少含半胱氨酸殘基的蛋白質有時候呈負染。銀染的詳細機制還不是非常清楚。
試劑:乙醇冰醋酸(純乙酸)、乙酸鈉硫代硫酸鈉、硝酸銀、碳酸鈉甘氨酸EDTA. Na2.2H2O、甲醛
實驗操作程序:
固定:30min或者更長時間 100ml 乙醇 40% 乙醇
25ml冰醋酸 10% 冰醋酸
加水到250ml
致敏:30min 75ml乙醇 30%乙醇
17g乙酸鈉 28.2g三水乙酸鈉
0.5g硫代硫酸鈉(大蘇打)
加水到終體積250ml
水洗:3 x 10min
銀染:20min 0.625g AgNO3
100ul 37%甲醛(在使用前加入)
加水到終體積250ml
水洗:2 x 1 min (注意把握時間,水洗時間長顯色速度慢,點的顏色偏黃色)
顯色:視情況而定 6.25 g Na2CO3
50ul 37%甲醛(在使用前加入)
加水到終體積250ml
終止:10min 3.65g EDTA. Na2.2H2O或者1g甘氨酸
加水到終體積250ml
保存:1%冰醋酸,4 ℃

注意事項


1.固定時間較長,則加一步水洗30min,以免膠太脆而破碎。
2.甲醛在使用前加入。
3.最好多配製一份顯色液,第一次顯色到溶液變混濁時換一份顯色液,顯色到點清晰。
4.顯色過程很快,要注意把握時間,避免染色過度。
5.銀染液和顯色液需要預冷。
6.所用器皿要很潔凈,不用手直接接觸,以免雜蛋白污染!
7.清洗用水盡量用高純度去離子水,蒸餾水更佳,可以減少背景著色。