人臍靜脈內皮細胞

從液氮中取出細胞凍存管，迅速放入37℃水浴中解凍至管內殘留一點冰屑。用75%酒精擦拭凍存管后，將內容物吸至一15ml無菌離心管中，逐滴加入預溫至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混勻，室溫1500rpm離心10分鐘棄上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗滌一次，離心后棄上清，加HUVEC完全培養液4－5ml備用，每支HUVEC凍存管含細胞量為5×10個。

1、細胞接種：

（1）、包被液：用去離水配製0.5%明膠溶液，過濾除菌。

（2）、培養瓶包被：取2-4個T25培養瓶，每個培養瓶加2－3ml0.5%明膠溶液，搖勻使包被液布滿培養瓶底面，置37℃2小時或放置過夜。

（3）、接種細胞：接種前吸凈包被液，按2500－5000個細胞/cm接種細胞（1支5×10個細胞可接種2-4個培養瓶），每瓶加培養液3-5ml,搖勻後置37℃5%CO2培養箱內培養24小時，此時細胞已完全貼壁，更換培養液後繼續在37℃5%CO2培養箱內培養。

（4）、擴大培養：一般每周更換培養液2次，至細胞長至覆蓋培養面的70-80%可進行傳代或凍存。

消化液：用pH7.0-7.2的PBS或D-Hank’S液，分別配製0.25%胰酶液和0.02%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。在細胞傳代或凍存前先消化細胞。具體操作如下：吸凈培養液，每瓶加消化液1ml，搖勻使其布滿培養瓶細胞面。37℃消化2-5分鐘。顯微鏡下看細胞回縮成圓形后，輕輕震動使絕大部細胞脫落後，每瓶加含10%FBS的RPMI-1640液的中和液4-5ml中和胰酶的消化作用，並用吸管輕輕吹打培養面使細胞完全脫落後，吸至15ml無菌離心管內。4℃1500rpm離心10分鐘棄上清，再用中和液洗滌細胞，離心棄上清，加適量RPMI-1640液，混勻后取10ul細胞懸液加10ul台盼藍混勻後作細胞計數，按需要做步驟四或五。

方法同步驟二。

調整細胞數2-5×10個/ml，按含細胞的RPMI-1640液ml數，配製等量的凍存液。凍存液中FBS佔80%，DMSO佔20%。例：含細胞的RPMI-1640液為8ml，應配凍存液8ml，其中FBS為6.4ml,DMSO為1.6ml，混勻。置細胞懸液於冰浴中，逐滴加入凍存液，邊加邊搖動。加完後用吸管吹打混勻。於冰浴中分裝細胞於凍存管中，1.8ml/管，再將凍存管置於凍存盒內置-80℃冰箱，24小時後轉入液氮中保存。