熔解曲線

總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關係。

擴增反應完成後，通過逐漸增加溫度同時監測每一步的熒光信號來產生熔解曲線，熔解溫度上有一特徵峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特徵峰就可以將特異產物與其它產物如引物二聚體區分開，因為它們在不同的溫度熔解線，隨著反應中雙鏈DNA變性，熒光染料又恢復到遊離狀態導致熒光信號降低，用熒光信號改變與溫度作圖，在擴增產物的只有染料法才需要做熔解曲線，探針法沒有必要，因為熔解曲線是由於染料法的特異性差，所以通過熔解曲線考察擴增產物是否是目標產物，與電泳的其中的一個目的相同，但熔解曲線畢竟是數學推導，並且結果中包含了儀器的誤差。

分析real time PCR 結果的特異性：出現單峰說明擴增產物特異性好，出現雜峰特異性差，存在非特異性擴增，如引物二聚體等。一般是用SYBR Green作為熒光染料的時候使用，因為SYBR Green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出熒光。做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出熒光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出峰位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的熒光，實驗結果有效。