在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步法不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。
在雙位點一步法測定中，應注意
鉤狀效應，類同於
沉澱反應中抗原過剩的
后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成
夾心複合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。單克隆抗體的應用使測定抗原的
ELISA提高到新水平。