顯微攝影

顯微攝影是把顯微鏡的物鏡和目鏡所組成的光學成像系統作為照相機的鏡頭去拍攝一般用肉眼無法看清的標本。這種對微小物體“放大錄像”，可直接為教學，科研提供方便。根據顯微鏡的結構可知：當被觀察的標本放在物鏡前焦點稍外一點的位置時，將在目鏡前焦點內側且靠近焦點的位置處形成一個放大倒立的實像，這時再通過目鏡（這時的作用象普通放大鏡）就可看到一個放大倒立的虛像。

如果調節物鏡成像的位置（可使標本適當遠離物鏡或升高目鏡，即增大目鏡與物鏡間的距離，使中間成像介於目鏡的一倍焦距與兩倍焦距之間），使物鏡所成的像位於目鏡前焦點的外側，此像再經過目鏡放大，即可在目鏡的另一側得到一個經二次放大的正立實像，當光源足夠強時，此像可使底片或相紙感光，或者使數碼相機、攝像機的CCD光電元件感光成像，這就是顯微攝影的原理。

要獲得一張好的顯微攝影照片，必須注意滿足以下幾個條件：1製作清晰的標本片，其中組織切片應厚薄適度，染色片不應有多餘的染料等。2選擇性能優良乾淨的載玻片和蓋玻片。3使用高性能的物鏡(最好用復消色差的平場物鏡)和聚光器。4採用Kohler照明法。5選擇好合適的拍攝膠片。⑥拍攝時應準確地聚焦和選擇合理的曝光時間。⑦正確的沖印方法。

下面以日本Olympus PM-10AD全自動顯微攝影裝置為例來介紹具體的操作步驟。

Olympus PM-10AD顯微攝影系統的裝配圖。

加選擇135相機拍攝時，首先應將適配器PM-PBS的上部裝上135照相機，前端裝上聚焦用望遠鏡PM-VTM。然後在顯微鏡的直筒部分加上適當倍數的NFK攝影目鏡(如3.3x)，並將上述PM-PBS安裝在該目鏡上。最後應將PM-PBS與自動曝光控制器PM—CBAD之間的連接線裝好並分別將顯微鏡和PM-CBAD的電源接通，並注意檢查電壓選擇範圍是否與所用電源相匹配。

在開啟顯微鏡和曝光控制器電源后，在安裝膠捲前，應按以下方法先檢查該裝置的工作是否正常。其方法是：先將曝光裝置PM-PBS上的光路控制拉杆向外拉出—個位置(綠色環)並把曝光控制器PM—CBAD上的曝光方式調至“AUT0”位，ASA速度至所用膠捲的感光速度ASA數值，這時再按下法檢查：

1)曝光控制器上的“SAFETY”綠色指示燈應亮。

2)輕按快門按鈕時，“WORK”燈應亮。

3)當快門關閉時，“WORK”燈應熄滅，並同時可見“WINDING”燈亮和聽見卷片的馬達聲。

操作時一般不取下相機，直接在本裝置上裝片或退片。正確的裝片方法如下：

1）將倒片鈕向外拉出，后蓋即打開。將135膠片放入倒片鈕下方的片槽內然後讓倒片鈕複位。

2)將片頭插入卷片軸縫隙中，注意不要讓片尖從袖縫的另一端伸出。按控制器上的進片按鈕(TIME OFF／WINDING)拖片直至使膠片兩端的片孔全部嵌入卷片齒輪中為止。

3)將后蓋重新蓋好，再按進片鈕拖片2-3次，直至計數器上顯示出“1”為止。

4)為避免忘記所用的膠片類型，最好將包裝盒的一角撕下，插入后蓋外部的插片腔中。

當膠捲全部拍攝完畢之後，控制器上的“FILM END”燈將點亮並出現報警

鈴聲。在取下相機或直接倒片后按“TIME OFF”鈕可使報警聲停止。

1)將相機上的退片鈕反時針旋轉90。

2)向外拉出退片手柄，順時針方向將膠片倒入暗盒，至拉力突然降低

轉無阻力時則表明膠片已全部倒入暗盒。此時即可開蓋取出已拍完的膠捲。

3)退片手柄在膠片完全退回后將自行複位。

先將拍攝標本準確聚焦，並用調焦望遠鏡選好待拍標本區。拍攝步驟如下：

1)將“MODE／EXPOSURE TIME”調至“AUTO”；按下“FORMAT”選擇鍵中的“35”；把“ASA”調至所用膠片的感光速度ASA值；將“RE-CIPROCITY，調至膠片的相應數值(可參見控制器底部的塑料說明板，除特殊要求外，通常應放在“4”位上)。

2)檢查SAFETY指示燈是否為綠色，若為紅燈應作以下檢查：A．若紅燈

閃現並同時有報警聲，說明曝光過度，應用中性濾光片降低照明亮度，一般不宜

採用降低電壓以減小照明亮度的方法。B．若紅燈連續亮則表明曝光不足，應增

加亮度。

3)將“EXPOSURE ADJ”調至適當值。一般用明視野照明而樣品又均勻分佈時，應調至(1)；若樣品分佈不均勻或用其他方式照明時則應進行適當的調整：

徠4)拉下控制器上的曝光鈕，“WORK”燈將隨著曝光而開啟，曝光結束“WORK”燈燈滅，膠片將自動驅進一個片位。

進行彩色攝影的基本方法除色溫調節外，其餘均與黑白顯微攝影相同。下面僅介紹調溫法；

1)將色溫檢測器PM-CTR安裝么自動曝光器PM-PBS的左側。

2)將標本片聚焦后讓視野移至無樣品的地方。

3)將光路控制拉杆移至最外部(黃色帶)；把色溫調節旋至“D”（日光型膠捲)或“T”(燈光型膠捲)。

4)在顯微鏡上加LBT(燈光型膠捲)或LBD-2(日光型膠捲)濾光片，調節顯微鏡的亮度使色溫調節器上的指示燈亮至A處(黃色)；若A處以上的綠燈亮表明色溫過高；A處以下的紅燈亮時表明色溫過低。

5)將光路控制桿向內推一步至綠環處，這時即可按上述黑白膠片的方法進

行顯微攝影。

在持殊情況下常常需要人為地改變曝光條件以求得更好的攝影效果經驗的操作者也可以選擇手動進行顯微攝影，其方法如下：

1)用“MODE／EXP0SURE TIME”鈕自行選擇曝光時間(可從1s-40min)。

2)按快門鈕，這時的快門將按設定的時間曝光。

3)若需要曝光時間超過40m可將“MODE鈕旋至T再按下快門鈕，快門將一直開啟，直至按動“TIME OFF／WINDING”鈕。

在對同一標本片的不同位置或不同成分進行攝影時，常常要採用相同的曝光

時間，這時可按下“AE LOCK”鍵。在此後的拍攝中將維持相同的曝光時間，“TIME RECALL”燈將閃亮，直至“AE LOCK”鍵被重新按動后才被解除。

A．先將“ASA”鈕旋至8倍於膠片ASA值處(如將100ASA膠捲旋至800處)。

B．將“FORMAT”選擇的“L”鍵按下，這時就能對同一底片進行多次曝光。

C.結束后按下“35”鍵和“WINDING鍵，膠片將自動前進一個片位。

雖然現在的相機均有自動測光或自動曝光功能，但是如果一個視野中亮處面積超過二分之一，則易出現曝光不足的現象，所以如果標本主體小，又處在亮背景中，就要適當增加曝光時間。

在控制曝光時，要注意以下因素：

光源強度的影響：由於電壓的變化，光源亮度可能產生5-10倍的變化。光源的距離及對標本的照射面積。光源的波長及色溫。光源的波長長、色溫低，色光偏紅時，曝光時間要長些。光波短，色溫高，色光偏青時，曝光時間要短些。電壓的波動會引起曝光量的改變，所以攝製過程中要保持電壓的相對穩定。聚光器的位置經過實驗固定后不宜改動。使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數增加曝光時間（手動曝光）。目鏡的放大倍率。以×5倍的目鏡作曝光基準1時，×10倍目鏡要4倍的曝光量，×15倍目鏡要增至9倍的曝光。物鏡的倍率和N·A值：如果把×10倍的目鏡作為1時，×40倍目鏡要2.5倍的曝光，×100倍的物鏡要4倍的曝光。從目鏡出射點到感光片的距離 標本的染色也會對曝光產生影響 標本與目鏡間的介質折射率大、曝光時間短，反之，曝光時間長。曝光時間與折射率成反比。聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產生2～20倍的變化。

顯微攝影的反差強一些為好，影響反差的因素有以下五個方面：

標本本身對反差的影響 標本切片厚會產生光的折反射，同時細部結構產生重疊。標本新鮮、色彩鮮艷反差強。標本載物片厚或蓋片厚、有色、有水紋都會降低反差。照明對反差的影響：照明應適中，否則會降低反差，太亮會衝擊標本細部結構，太暗會使光路中的臟物呈現在影屏上。光束直徑與視場直徑一致時反差強，光束直徑大於視場直徑就會降低反差。集光器與虹彩對反差的影響：集光器過低、虹彩與光欄小，都會降低反差，所以要依具體情況升降集光器或開放虹彩。虹彩光闌的直徑必須與物鏡口徑一致。濾色片對反差的影響：用補色濾色片反差強，用統一色濾色片反差弱。

光學顯微攝影的反差雖然是大些為好，但也要適當處理，不然反差過大就會損失細部結構，同時也會影響解析度，同樣不能得到完美的效果。

附：光學顯微鏡的構造、成像和性能

現代光學顯微鏡，基於不同用途、種類繁多，如有生物顯微鏡、金相顯微鏡，解剖顯微鏡 等，但基本結構仍為光學和機械兩個部分。

單式光學顯微鏡（通常用的放大鏡、解剖鏡等）光學結構簡單、放大倍數小、光行差明顯，不宜進行顯微攝影，在這裡就不作介紹了。

複式顯微鏡光學系統比較完善、機械裝置比較複雜，適合於顯微工作的開展：

1.顯微鏡的成像

顯微鏡的成象光路：

它通過目鏡、物鏡等光學器件構成放大光路，而使所得虛像A“B”的距離恰好等於人眼的鳴視距離——250毫米，以獲得將標本放大10～200倍的可見影像。

2.光學顯微鏡的基本結構

光學顯微鏡的基本構造分為兩部分。一部分是光學系統，如接目鏡、接物鏡、聚光器、光源等，另一部分是機械系統，如鏡腳、鏡臂、鏡筒、載物台、物鏡轉換器、大小螺旋、推進器等。

（1）接物鏡

接物鏡是光學顯微鏡的關鍵部件，整個顯微鏡系統的成像質量與解析度都由接物鏡決定。它 由一組精密的透鏡組成，其作用是將檢視標本做第一次放大。顯微接物鏡生產時做過各種像 差校正，它有一個光闌——孔徑光闌，可以控制入射光束的直徑，其作用是減小或擴大視場 而不改變像的明亮度。

接物鏡有不同倍率其中乾燥系用在正常情況下觀察。水浸系或油浸系在觀察時要 在接物鏡口與標本結合處點水或點油。

由於接物鏡的成像質量影響攝影效果和觀察效果，所以接物鏡也是顯微攝影的重要組成部分。

接物鏡有三個主要參數——數值孔徑N·A值、放大率和蓋片厚度。它們都標在鏡頭殼上。

①N·A值

數值孔徑N·A是標誌物鏡工作性能的重要參數，它決定了物鏡的解析度。N·A=n·sinθ 式中n為介質折射係數，Q為入射角。

表明了物鏡數值孔徑與介質折射係數、入射角的關係。理論上的最大入射角為180°，它的一半（90°）的正弦等於1，而空氣的折射係數為1.0，水的折射係數為1.33，松節油的折射係數為1.5，所以在同樣入射角情況下液浸物鏡數值孔徑比乾燥物鏡的大，因此分辨能力也大得多。

N·A值越大，解析度越大，N·A值越小，景深與焦深越長。

N·A值尚與鏡口角有關，鏡口角越大，進光量越大，所視像野中的影像越清楚，解析度就越 大。反之，解析度就小以致看不清楚。由於低倍物鏡的鏡口角小於高倍物鏡的鏡口角，所以低倍物鏡的解析度就不如高倍物鏡的解析度大。（這是指乾燥系而言，油浸系物鏡有介 質的折射率，可提高解析度。

解析度還受照明強度及光源波長的影響，在一定範圍內，照明強度大，分辨力就大。

②放大率

放大率是指檢視的放大倍率（即虛像放大倍率），倍率越大，工作距離越近。對每個具體物 鏡來講，它的放大倍率是不變的，工作距離也是不變的。如果採用10×目鏡、40×物鏡，觀 察時放大了400倍，但對顯微攝影來講，由於要增加目鏡到 感光片的這段距離就不是400倍了，有些顯微攝影的攝影倍率是顯微鏡放大倍率的1/2。

③對蓋片厚度的要求

顯微鏡對蓋片的厚度要求為抽筒的1/100,達0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒則必須相 應改動10毫米，否則其放大倍率就不是標示的倍率了。

油浸鏡是借點油的折射率來提高視野的亮度和解析度。點油后使接物鏡 與標本構成一個光具組。

常用於油浸鏡的點油及折射率為：

洋杉木油1.51

檀香木油1.51

甘油1.46

樹膠1.52

蘇合香1.58

折射率越大呈像亮度越強，解析度也就越大。

（2）接目鏡

接目鏡主要有以下兩個作用一是將物鏡送來的初級放大影像再作第二次放大。

二是矯正接物鏡成像中的相差、色差和照度。接目鏡的放大率一般從×4～×25，其鏡筒長的放大倍率大，反之，放大倍率則小。

眼點是目鏡的一個主要參數，在顯微攝影中為尤重要。眼點即顯微鏡對清焦點后在目鏡上形 成的出射點。一般眼點距離目鏡0.5厘米左右，放大倍率越大，這段距離越短，放大倍率越 小，這段距離越長。目視時，瞳孔恰與此點相接，用帶鏡 頭的照相機攝影時，鏡頭的前片透鏡表面要與此點相接，用不帶鏡頭的攝影裝置拍攝時，要 從眼點計算所加近攝裝置（伸縮皮腔形式或近攝接圈）的伸長尺寸，以計算實際倍率。

（3）聚光器

顯微鏡的聚光器有明視野聚光器、暗視野聚光器和特殊用途聚光器（如偏振光、相位差等等）。

①明視野聚光器

明視野聚光器由集光器、虹彩、濾色鏡環和反射鏡四個部分組成。

其中集光鏡由兩個或兩個以上透鏡組成，象一個簡單的照相機鏡頭，它的數值孔徑（N·A) 值為1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物鏡對標本的解析度。

②虹彩

結構像照相機的光圈，它不但可以調節照明強度，同時還具有改變解析度和反差的作用，即：虹彩開大，分辨力高，反差弱，虹彩縮小則相反。濾色鏡環用來放置濾色片或毛玻璃，可 用來改變光色或亮度。

反光鏡分為平凹兩面，並要使光束正好對準反光鏡中央。

③暗視野聚光器的視野背景是暗的，被攝體是發光的或明亮的。

暗視野聚光器通常用於拍攝極微小的物體，如化學明膠、梅毒螺旋體或明視野看不見、看不 清沒有染色的標本。它也常常用於熒光顯微攝影。使用暗視野聚光器拍攝時光源亮度要強些，不能使用濾色鏡。為防止外來光線干擾，暗視野 顯微攝影最好在暗室中進行。

3.光學顯微鏡的主要性能

光學顯微鏡的主要性能從兩方面體現，即放大倍率和解析度。

（1）放大倍率

理論上講，光學顯微鏡的放大倍率在鏡筒長度為16～17厘米時為物鏡×目鏡倍率，但是我們 要 將實物看清，不僅僅是要將其放大，更主要的是分辨出它的細部形態，所以放大倍率要與物 鏡、解析度同時考慮。如，同樣是放大200倍的顯微鏡目鏡與物鏡，可以有三種組合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三種組合形式的解析度、焦點深度與成像面的亮度、拍攝時需 要使用的快門速度有很大差別。

物鏡（1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20

物鏡的數值孔經 分辨能力 焦點深度 焦平面亮度比 照相快門速度 0.40 0.70µ 1.25µ 1.0 1/30秒 0.65 0.43µ 0.77µ 0.8 1/200秒 0.25 1.1µ 2.0µ 0.4 1/40秒

在顯微攝影中，其放大倍率與出射點至感光片的距離有關，所以顯微攝影的放大 倍率的計算公式為M=物鏡倍率×目鏡倍率×目鏡出射點至底片的距離/250毫米。這個公式說 明，只有當目鏡出射 點至感光片的距離為250毫米時，顯微攝影的放大倍率才等於物鏡倍率×目鏡倍率，若將目 鏡 出射點到感光片的距離加大，其放大倍率也隨著加大，但這只是形態增大而解析度不變。將 底片用來放大照片時也只是形態的放大，而不增加解析度。

一般為溴化銀乳劑，將其塗在膠片上就成為膠捲(底片)，如果將其塗在紙上就成為感光紙，曝光時在光的作用下部分溴化銀粒子被還原成金屬銀而形成潛像，這就是拍照過程。再經過顯影液的作用，潛像就變成黑色金屬銀留在乳劑中，金屬銀還原的多少即黑度的深淺與曝光時間的長短和光的強弱及波長有關，再經過定影液作用，將未還原的溴化銀熔解在定影液中，底片該處就呈透明，這時底片呈現與實物相反的影像，叫做負片。用印相紙複印，就能得到平常所見的照片，(複印是將印相紙的葯膜面和底片的葯膜面緊貼后曝光，再經顯影、定影處理后即得照片)。

實用顯微攝影的方法主要有三種（註：不包括本實驗所用的相紙感光）：

第一種方法是利用傳統的菲林相機，讓被攝物體成像於黑白或彩色膠片上，製成負片，再把它沖印放大成照片（正片），以便觀察研究和永久保存。或者讓被拍攝物體成像於反轉片上，直接製成正片，用於幻燈投影。要求不高時也可直接成像於相紙上，成為一負片，並不影響相片的解析度。本物理實驗室為本、專科學生提供這一顯微攝影廣方法。

第二種方法是利用數碼相機，通過專用接筒或外接專用鏡頭，把被攝物體成像於數碼相機的內存中。成為一個壓縮的JPEG文件，傳輸到計算機中，再利用圖像顯示軟體把圖像顯示於監視器上，或者直接通過印表機輸出相片來。也可把圖像存貯於媒介上，如軟盤、快閃記憶體盤、光碟等，再通過數碼沖印商店，沖印出數碼相片。由於目前市場上大多數數碼相機都是不可變換鏡頭的相機（除了個別昂貴的專用數碼相機，如Nikon的Ｄ1型相機外），所以顯微鏡不設連接數碼相機的卡口，而通過加設一鏡頭接筒的方法，再連接某些特殊鏡頭結構的數碼相機，如本實驗採用的Nikon Coolpix 4500型數碼相機。

第三種方法，則是在顯微鏡上加接專用連接鏡頭，接上CCD攝錄鏡頭，再把動態的圖像傳送到計算機，通過軟體在顯示器上表現出動態圖像來，可把Video圖像存儲成某種格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬間的影像保存到計算機中，成為儲存器上的一靜態圖像的文件，如bmp、tif或jpg等，與數碼相機所獲得的圖像相似。這種方法的優點是能夠獲得動態圖像，在視覺效果上更生動、更勝一籌。不過其靜態圖像的分辯率一般只能用於電視機或顯示器上的顯示，並不適合於列印輸出和印刷等領域。