三級生物安全櫃提供一級，二級安全櫃無法提供的絕對安全保障。所有三級生物安全櫃都是，並且採用完全密閉設計。實驗操作完全通過前窗的手套進行。在日常操作過程中，安全櫃內部將一直保持負壓狀態。即使在物理防污染系統出現故障的情況下，它也能防止污染。
所有三級生物安全櫃經
HEPA過濾器過濾后的潔凈空氣提供產品保護，並且防止樣品
交叉污染的情況出現。廢氣通常經由
HEPA過濾。或者將兩個HEPA過濾器並排使用。實驗所需的物品同過安置在安全櫃側面的隔離通道送進櫃內。三級安全櫃通常直接將廢氣排到實驗室。然而，空氣也可以通過外接的排氣管道直接排到外界環境。當使用排氣管道系統的時候，三級安全櫃也適用於在試驗中需要添加有毒化學品的
微生物操作。所有三級生物安全櫃都可在涉及一，二，三，四級
生物安全水平的微生物因子實驗中使用。尤其於。
