硝酸纖維素膜NC膜

購買回來的原料硝酸纖維素粒子是一種非常普遍的有機化學物，溶解形成混漿，在該漿體內，通過加入一定比例的試劑來調整最後形成的膜的性質，一般主要包含表面活性劑/高分子聚合物/鹽離子/成型劑等溶解的一個緩衝體系內。不同的廠家加入的溶液配方不一樣，導致了產品的差異。

配好的勻漿通過滾筒，形成了一張薄膜，平攤在十分光滑的平面載體上。過程與造紙非常相似。

當勻漿內的成型劑開始揮發，膜逐步乾燥成型。同時在這個過程中由於溫度比較高，有些廠家在這個過程採取了在密閉腔體內成型，同時補充配方溶液的形式，來避免一些有效成分的蒸發。

通過以上步驟生產出來的膜是呈一個寬度極大的產品，寬度的大小直接和滾筒的大小相關，滾筒越大生產越方便，但設備的成本也越高。寬膜要經過切割才能成為我們購買到的25mm或18mm（或20mm）寬的膜，而長度上，成品卷膜和寬膜的長度是相同的。理論上可以讓廠家切成你需要的任意寬度，但這樣會造成原料的浪費和人力成本的增加，後來廠商在和試紙生產廠家的協調過程中，綜合用料成本和生產便利性基本確定了上面說的寬度，以此為標準。

從生產過程，我們可以得知，NC膜本身已經添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經存在有一定的緩衝系統（雖然對紙條測試影響不會很大）。

現在有銷售的NC膜品牌型號如下：

PALL(美國)

MILLIPORE（美國），M135（有背襯/無背襯兩種） M180（有背襯/無背襯兩種）

WHATMAN and SS，Puraband impuraband

SARTORIUS（德國），CN140

伊能（國產），8um 6um

泰滋德 TEST（國產）8um 6um

MDI（印度），8um 6um

說到這些供應商，不得不談談發展的歷史. SS是膜行業的鼻祖，這點所有的膜公司都承認。millipore，SARTORIUS和whatman都是後輩，由於SS在市場競爭的過程中經營方式落後，最後被whatman收購。就產品質量來說SS的AE99和AE98是非常優良的。

而MDI是近年才出現的一個膜公司，可能與印度膠體金試紙生產行業的快速發展密切相關，其所有的產品都是在印度生產，經營者為父子兩人，父親負責技術，兒子進行經營。

國產膜伊能主要特點成本較低，性能與一些進口膜很接近，經過一些有針對性的優化后可以用在HCG產品的生產。但不是所有的工廠都能購輕易的完成這個優化工作。膜的國產化是一個趨勢，但進口廠家要實現國產化還面臨很大的問題，其中廠房設備的搬遷就是一個非常大的問題。

幾家供應商的國內聯絡人和技術支持分別是

PALL（美國），Mr Xiaoliang Tang, Dong Wang

MILLIPORE（美國），Mrs Yang，harry

WHATMAN and SS，Clark，kevin

SARTORIUS（德國），Mr Xu，Iric

伊能（國產），connie，Mr Yang

泰滋德 TEST（國產）Mr li

MDI（印度），Ashawant Gupta

銷售模式都是直銷式，少量購買需通過代理商購買。價格上PALL、MILLIPORE與WHATMAN相當，SARTORIUS便宜一些，國產膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS價格相同。在科研市場，PALL、MILLIPORE使用最多。生產客戶中，MILLIPORE，HATMAN，SARTORIUS佔有量相當，伊能現在也開始有一些工廠客戶了，MDI量最小投訴也最多。

以上談了該行業的一些發展現狀，那麼我們大致了解后，回到最關心的問題，如何選擇膜？經常會遇到的問題是，我是做**項目的，我該選擇那類膜？

這裡涉及到一個膜的分類標準問題，一個供應商可能提供這個膜是8um，但另一個供應商告訴你膜是135s的。這之間的區別與聯繫是什麼？

um指的是膜孔徑，而從上面膜的生產過程，我們可以看出，膜的孔徑實際上是沒有辦法界定的。由於乾燥成型等過程的非絕對均一，膜的孔徑也是非均一的。膜孔徑的說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼。而以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是***s.該單位已經越來越被各大廠商所接受，成為了一個通用的比較標準。以下我們將採用s單位來進行交流。

換算情況大致為：8um=135s；6um=180s

不同秒數的膜對反應有什麼影響呢？

首先，我們分析一下液體在膜上的運動過程。一張長度為4cm的膜，每隔1cm做一個標記，當液體運動過標記處時記錄時間點. 那麼你將會發現液體在膜上的運動是呈減速前行的。而兩張不同秒數的膜（例如135s， 180s）在同一時間標記點處的運動速度不同。這個試驗用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。

那麼從這個試驗可以看出，在通過同一T線噴點位置時，金溶液通過的速度是快速膜>慢速膜。那麼通過速度越快和包被在T線的物質反應時間也就越短，讀數快，那麼靈敏度也就越低。反之，反應時間長，讀數慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應時間越長，發生非特異性結合的可能性就越大，所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這裡就有一個讀數時間/反應靈敏度/非特異性結合的均衡。

其實我們並沒有那麼多選擇。經過使用實踐，各供應商一般都只提供兩個型號，就是135s和180s。雖然看到有些廠家的產品目錄上型號種類繁多，但這兩個型號的定貨量就佔了95%以上，其他型號供貨上也就遠不如這兩個型號來得順利。135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. 你所要做的是，先選擇其中的一個型號，然後比較不同供應商同一個型號的差異，由於前面說的添加配方與你的試驗條件配合的不同，這個差異可能大也可能小。具體要根據試驗結果來確定最後的選擇。我個人不建議地毯式的測試不同規格/不同廠家的膜，這樣成本高，成功的幾率也小。

本節適合用膜量較大的公司用戶參考。對於一卷膜可以用上幾個月的用戶來說，廠家的質控標準已經完全能滿足你的要求，而不需要自己再做相關的質控。

膜的質控雖屬於原輔料QC職能，但由於其專業性強，一般都由小樣調試人員來執行。膜入原料庫后需要進行如下檢驗工作：

1. 查收COA

在購買時，供應商會隨產品為每個lot的膜提供一張紙質的出廠質量證書，該證書被稱為COA。如果你已經購買某一批次的膜，而沒有索取相應的證書，如果有需要可提供批號向廠家要求補發。其實在很多行業都有廠商為自己的產品附上COA的習慣。

COA一般只提供給大客戶，對小客戶是沒有意義的。其內容主要是廠家在產品出廠時做過一些測試的羅列。作用可以理解為質量憑證和測試數據參考。

2. 檢查物理性能

膜的物理性能主要是2個參數，膜厚度和寬度。長度不需要檢測。使用中可以關注長度上是否有斷面重接現象，斷面多費料則多，少數發生。厚度，由螺旋測微尺，選擇幾個測量點檢測后算平均。膜生產的必測參數。主要表現為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴散性能，點出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速。寬度，普通直尺測量。物理性能一般都不會有什麼大問題。畢竟檢測標準客觀，易把握。沒有條件執行的廠家可省略。

3. 跑水性能

樣本採用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易觀測，需製作一個簡易支架。

操作：注入足夠溶液到下部槽內，將不同批次膜每隔1cm做一次標記（總長大於4cm）並放到傾斜支架，整個支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計時。記錄每個標記處的通過時刻，並與對照組比較。跑板時，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反常現象。

4. 點樣測試

C/T線出線時間，其他試驗條件相同情況下，記錄和比較C/T線出現時間是否與對照有差異。

靈敏度，比較不同樣本濃度情況下，T線的變化是否和對照組同。一般每批次膜取前端一段用來測試即可。由於製造過程的不均一性，不同批號的靈敏度會有一定差異，當大批量使用時，這種差異影響是非常大的，那麼就要按照靈敏度表現將不同批號的膜進行分類。在膜的STOCK中要能夠輕易的分辨出來。當進入後期生產調用時，就能根據這些分類，按照訂單要求取用不同批號的膜，或者用強靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配。

關於膜的批內差。批內差是肯定存在的，只是差距大小的問題，依據一般的測試條件是很困難獲得詳細的數值，因為你不可能對每一卷膜的每一段都做詳細的測試。減小膜批內差的最有效方法是不購入邊緣膜帶。前面說過膜的生產方式，生產出的半成品是寬幅很大的一個膜面，要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度。那麼就有中間部分，和邊緣部分之分。越靠近中間部分，膜的均勻性越好，邊緣部分則相對要差，就造成了批內差。一般可以通過COA獲得具體位置信息，例如MILLIPORE就在切割後用字母A，B，C……來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置。

如果是試用某個型號的膜小樣，還需要在以上檢測后加入膜加速老化試驗，包括膜單獨的老化試驗和點好膜后產品的老化試驗，具體試驗方法請參看我以前寫的研發思路一文。

從本節開始，我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧。

1. 蛋白與膜的結合原理

蛋白與膜的結合原理，已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：

1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。

2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。

兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。

2. 膜對結合的影響

1）膜孔徑

有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這隻僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關係，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。

另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標複合物通過T線的時間也就越長，反應也就越充分。

綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高。所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。

2）不同廠家的膜差異

這個差異主要來源於兩點：

1> 生產膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數量不同。同理，在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響。 2> 處理過程不同。

3. 生物原料，緩衝溶液的試劑和配方

1）生物原料，作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這裡只做略述。

首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。

2）緩衝液

大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩衝液，封閉液等等處理溶液配方。

其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支持，而不同機構的反應體系又有差異。想獲”魚”先學”漁”.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。

緩衝液的構成一般是：PBS（或其他緩衝體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料后，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要添加作用物質，原來的很多需要添加的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。

推薦的緩衝體系為0.01M PBS PH7-7.2，該緩衝體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。

作用物質的情況大致羅列如下：

少量NACL，減少信號強度，消假陽。

有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。

表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。

糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。

調PH到某個位置，可以消假陽。

4. 點樣環境

環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。

5. 點樣儀器與膜面情況的關係

目前有兩種點樣方式，划膜式和非接觸點膜式。非接觸點膜式優於划膜式，進口划膜式優於國產划膜式。

因划膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，划管會在其表面留下印痕。進口的划膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的划痕較輕，而國產儀器較差，留下的划痕也就比較嚴重。划痕容易對層析的金標複合物形成阻力，導致假陽性。同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束后鬼線消失的奇怪現象。

6. 膜的寬度與點樣位置

膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種，分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標複合物通過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。

7. 溶液在膜上的擴散

溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。

8. 點膜前後的封閉作用

從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的，直接點膜就可使用。然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分佈。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。

我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要通過穩定性測試來評判。

9. 膜的儲存

剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用后靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入調試生產。

硝酸纖維素膜NC膜

規格: 15X20cm

孔徑: 0.45μm

保存: 5-15℃密封保存，保質期一年

產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆，濕時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。

1.分子雜交

雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。

固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物上；第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測。

用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交並進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。某特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然後將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內。例如。可用特異性的細菌、病毒的核酸做為探針對組織、細胞進行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對於組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。下面以放射性標記探針與固定在NC膜上的核酸進行雜交為例，雜交反應操作如下：

① 配製所需試劑

SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。

Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。

預雜交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5%SDS，100?g/ml經變性或斷裂成片段的鮭精DNA。

② 將含靶核酸的NC膜漂浮於6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤，並繼續浸泡2分鐘。

③ 將濕潤NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預雜交液，儘可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時或過夜。

④ 將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即於100℃加熱5分鐘，然後立即置冰浴使驟冷。

⑤ 從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，儘可能將袋內空氣擠出去，重新封口，並將雜交袋裝入另一個乾淨的袋內，封閉，以防放射性污染。

⑥ 將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時。

⑦ 取出雜交袋，剪開，取出濾膜迅速浸泡於大量2×SSC和0.5%SDS中，室溫振蕩5分鐘，勿使濾膜乾燥。

⑧ 將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鐘。

⑨ 將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鐘至1小時。

⑩ 將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鐘至1小時。

⑾ 取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然後置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號的檢測。