外周血單個核細胞

單個核細胞是血液白細胞中具有單個核細胞的一個含糊術語。以淋巴細胞為主，也包括少數單核細胞、漿細胞等。外周血中單個核細胞的相對密度在1.076-1.090之間，常用相對密度1.077±0.001聚蔗糖-泛影葡胺作密度梯度離心加以分離。

淋巴細胞來源於造血幹細胞(hemopoietic stem cell，HSC)。造血幹細胞可分化成多能前體細胞( multipotent progenitor cell，MPC)，繼而分化為淋巴樣幹細胞和髓樣幹細胞。淋巴樣幹細胞可繼續發育為成熟的T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞等。骨髓、胸腺造血微環境是造血幹細胞分化發育的主要場所。

一、基本原理

外周血單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其比重為1.070左右，而紅細胞和多核白細胞的比重超過1.080。這樣利用介於兩者比重之間的溶液(稱為分層液)做密度梯度離心，就可得到單個核細胞。最常用的分層液為聚蔗糖和泛影酸鈉混合比重為1.070±0.001的溶液，國內常用泛影葡胺代替泛影酸鈉。

二、試劑與器材

1、聚蔗糖—泛影葡胺分層液，Hank’s液，RPMI-1640培養液，肝素。

2、水平離心機。

三、操作步驟

1、取外周靜脈血，用肝素抗凝，加等量的Hank’s液並混勻。

2、將分層液加入試管中，用量約為血量的1/2。用吸管沿管壁緩緩將血加入分層液面上。

3、置於水平離心機離心，1500r/min，10min。可見絕大多數單個核細胞懸浮於血漿和分層液的界面，呈白膜狀。

4、用尖吸管吸取界面的細胞層，置於另一試管中，加入適量的Hank's液，混勻后以1000r/min，離心10min，棄上清。

5、同法洗滌細胞2次。

6、將細胞重懸於RPMI-1640培養液中，4℃保存備用。

四、注意事項

1、在分離外周血單個核細胞過程中，將稀釋血液加於分層液上時，要避免衝散分層液面，而要使之形成良好的界面，否則影響分離結果。

2、此法操作得當，單個核細胞得率可達80%-90%，影響得率最重要的因素是分層液的比重。

因為血液中各有形成分的比重存在差異，因此得以分離。紅細胞和粒細胞密度大於分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積於管底。血小板則因密度小而懸浮於血漿中，唯有與分層液密度相當的單個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經洗滌離心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95%，淋巴細胞約佔90%～95%，細胞獲得率可達80%以上，其高低與室溫有關，超過25℃時會影響細胞獲得率。

周血單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。單個核細胞的體積、形態和比重與外周血其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞的比重在1.092左右，單個核細胞的比重為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035。因此利用一種介於1.075-1.092之間而近於等滲的溶液作密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分佈，可將各種血細胞與單個核細胞分離。