基因表達譜

基因表達譜的獲得與表示

在基因晶元的實驗中，首先選取來自不同狀態的樣本，如正常組織與腫瘤組織、不同發育階段組織，或用藥前後的細胞或組織等。其中一種被稱為實驗樣本，另一種就是相應地被稱為參考樣本。實驗樣本和參考樣本mRNA在逆轉錄過程中，分別用不同的紅、綠熒光基團標記，並將它們混合，與微陣列上的探針序列進行雜交，經過適當的洗脫步驟后，用激光掃描儀對晶元進行掃描，獲得對應於每種熒光的熒光強度圖像，通過專用的圖像分析軟體，可獲得微陣列上每個點的紅、綠熒光強度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）稱為該基因在實驗樣本中的表達水平。

Step1：基因晶元的製備。在硅膠、玻璃片、聚丙烯或尼龍膜等載體上按特定的排列方式固定大量的探針，形成DNA晶元。晶元種類較多，製備方法也不盡相同，基本上可以分為兩大類：原位合成和直接點樣法。

Step2：熒游標記探針的製備。將待分析的基因探針在晶元雜交之前進行純化、逆轉錄或擴增級熒游標記。最普遍的熒游標記法是用Cye3-dUTP(綠色熒光)標記對照樣本，Cye5-dUTP(紅色熒光)標記實驗室樣本。

Step3：標記探針與晶元雜交。選擇雜交條件，將製備的熒光探針與晶元進行雜交，一定時間以後，洗去未結合探針，然後進行熒光信號的掃描與分析。

Step4：雜交晶元的掃描。雜交后的晶元用特定波長的激光進行激發，此時晶元上的探針會發出不同波長的熒光。用共聚焦激光掃描儀檢測探針的熒光強度，可以得到Cy5和Cy3的兩幅單色圖像。分別對這兩幅圖像進行偽色彩處理，然後疊加稱為一幅圖像，這就是實驗所得到的原始數據——雜交圖像。圖像中樣點的熒光強度值間接給出了基因晶元中對應探針的相對丰度值。如果來自測試樣本的表達丰度高，那麼樣點呈紅色；如果來自參考細胞樣本的表達丰度高，那麼樣點呈綠色；如果兩者丰度相當，樣點就呈黃色；如果二者沒有進行雜交反應，則樣點保持背景黑色不變。通過這種方法，取自兩個不同樣本的基因相對表達水平差異就可以表現出來。

Step5：將基因表達譜數據從雜交圖像中提取出來，即將原始雜交圖像轉化為基因表達譜數據。

腫瘤在組織形態學上被劃分為多種不同的類型和亞型，而腫瘤亞型的準確診斷對腫瘤的臨床治療具有重要意義，然而腫瘤的分型在臨床上一直處於難以處理的狀態，許多形態學上相似的腫瘤，如白血病的許多亞型等都會有相似的臨床癥狀，但卻需要不同的治療方法，從分子生物學的角度上看，腫瘤是由於某些染色體上DNA損傷致使細胞內基因異常表達，導致細胞生長失控、缺乏分化和異常增生的一類複雜基因疾病。正因為腫瘤發展機制的複雜性，100多年來的研究仍未揭開其中的奧秘。研究腫瘤基因表達譜、選取信息基因是從信息學角度出發以尋找腫瘤相關基因、發現腫瘤基因表達特徵的直接手段。腫瘤基因表達譜數據顯著特點是樣本的位數高而樣本很小、雜訊冗餘大而信息基因少。每個樣本都記錄了組織細胞中所有可測基因的表達水平，但實際上只有少數基因才真正同樣本類別相關，它包含了樣本分類的信息。信息基因選取問題是腫瘤基因表達譜分析的核心內容。它既是建立有效分類模型的關鍵，也是發現腫瘤分類與分型的基因標記物以及藥物治療潛在靶點的重要手段，目前人們對該問題已進行了一定程度的探索。然而，如何在基因表達譜的成千上萬個基因中有效選出樣本的分類特徵，一直是腫瘤基因表達譜分析中的難點所在，這個問題仍有待深入研究。

當前的腫瘤分類技術高度依賴病理學工作者對腫瘤組織的主觀判斷，而基於微陣列技術，即使一些組織沒有顯著變化，利用基因表達譜也能夠對之做出早期診斷；基於基因表達譜的腫瘤分型和分類研究為理解腫瘤的發生的機制，以及腫瘤的臨床治療提供了重要依據；研究人員可以根據基因表達譜的變化來區分形態學上相似的腫瘤，而腫瘤類型的精確診斷將有助於制定配套的最佳治療方案。