細胞生長

培養細胞生長過程：潛伏期→指數增生期→停滯期

一、潛伏期（latent phase）：

細胞接種后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時，細胞質回縮, 胞體呈圓球形。然後細胞貼附於載體表面，稱貼壁，懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類，培養基成分，載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養細胞貼壁速度慢，可達10-24小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。原代培養細胞潛伏期，約24-96小時或更長, 連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24小時。

二、指數增生期(logarithmic growth phase)

這是細胞增殖最旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標誌。通常以細胞分裂相指數（Mitotic index, MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介於0.1%-0.5%，原代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達3%－5%。

指數增生期的細胞是細胞活力最好時期，是進行各種實驗最佳時期，也是凍存細胞的最好時機。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3－5天後，隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少，最後細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑制現象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象，能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發生接觸抑制，但只要營養充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象（Density Inhibition）。

三、停滯期(Stagnate phase)

細胞數量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數持平，故也稱平台期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養液中營養耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒，出現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因此，應及時傳代。

細胞生長受溫度、滲透壓等外界因素的影響。

一般哺乳類及禽類細胞體外培養的適宜溫度是37~38℃。溫度過高或過低都會影響到細胞的生長。細胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強，在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂降低。溫度不低於0℃時，雖影響細胞代謝，但並無傷害作用；把細胞置於25～35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減緩；放在40℃數小時后，再置回37℃培養細胞仍能繼續生長。但如果在40℃下暴露時間太長，對細胞生長不利，甚至變圓脫落於瓶壁。若溫度過低，在降到冰點以下時，細胞因胞外水和胞質結冰而受損死亡。但若向培養液中加入甘油或二甲亞碸等保護劑，封入安瓿中后，置於液氮中，可起保護作用，此時細胞可耐受-70℃以下溫度，能長期儲存，解凍后細胞復甦，仍能繼續生長增殖，細胞生物性狀不受任何影響。此為保存細胞的主要手段。

。細胞在39～40℃培養1小時，能受到一定損傷，但仍有可能恢復，但不能忍受溫度再升高2℃，持續數小時，即在41～42℃中培養1小時，細胞損傷嚴重，溫度至43℃以上時細胞多數被殺死。高溫主要引起酶的滅活、類脂質破壞，核分裂的破壞，產生凝固酶使細胞發生凝固，另外使蛋白質變性。因此，體外培養細胞時一定要避免高溫。

細胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外培養細胞的重要條件之一。哺乳動物和其他動物組織細胞體外培養的滲透壓的維持主要與NaCl有關，但不能忽視其他電介質滲透壓的關係。滲透壓與單位體積溶媒內溶質的分子數和離子數成正比。為此，按一定比例控制培養液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的。這不僅是為了維持細胞張力，而且是為了調節細胞的代謝。因為細胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養物質的輸送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影響細胞基本合成系統。

理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為290mmol/L，被視為是體外培養人類細胞的理想滲透壓。哺乳類動物細胞的滲透壓一般為290～300mmol/L。人胚肺成纖維細胞為250～325mmol/L，鼠則為310mmol/L左右。在實際應用中，260～320mmol/L的滲透壓可適於大多數細胞。

體外培養細胞需要理想的氣體環境，氧和二氧化碳是細胞生存必須的條件之一。氧參加細胞的三羧酸循環，產生能量以供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。有些細胞在低氧條件下，可借糖酵解取得能量，但多數細胞低氧時不能生存。氧張力通常維持在略低於大氣狀態，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。採用開放式培養時(碟皿或培養瓶松蓋培養或培養板培養)，一般要把細胞置於95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環境中。

CO2既是細胞的代謝產物，又是細胞生長所必需的成分，並與維持培養液的pH有關。在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下，細胞容易生長；一般不能低於1%，否則有損細胞。CO2增加將使pH下降。大多數細胞適於在pH7.2~ pH 7.4條件下生長，低於pH6.8或高於pH7.6對細胞有害，甚至退變或死亡。各種細胞對pH的要求不盡相同。一般原代培養細胞對pH的變動耐受性差，永生性細胞系和惡性細胞對pH的變動耐力強。但總的來說，細胞對鹼性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏鹼的環境對細胞生長有利。細胞在生長過程中隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，不斷釋放CO2，使培養基變酸，pH發生變化。所以，為了維持培養環境恆定的pH，多採用在培養液中加入磷酸鹽等緩衝劑的方法。磷酸緩衝劑中的NaHCO3可供給CO2，但CO2易於逸出，故只適用於封閉式培養。若開放式培養還是置於含有5%CO2的氣體環境中為宜。為克服NaHCO3調整的麻煩，也可用羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid, Hepes)，它對細胞無毒性，也不起緩衝作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養或活細胞觀察時能維持較恆定的pH。

無毒和無菌是體外培養細胞的首要環境條件。細胞在活體內，偶爾有細菌或有害物質入侵，因體內有強大的解毒系統和免疫系統，可將其解毒或清除，而不易受損害。但在離體的環境中，失去了防禦系統，一旦有害物質入侵或細菌污染，可導致細胞死亡，前功盡棄。如培養瓶皿、支持物、培養基、瓶蓋、瓶塞上若有細胞毒性，在培養過程中可導致細胞死亡。因此，在選用這些器皿、材料時要注意，若這些物品消毒不徹底，帶菌或操作過程不小心使細胞污染，也會導致細胞死亡。若出現交叉污染，可使實驗室原來的細胞系失去原有特性，應引起足夠的重視(後面有詳述)。

(一)可見光

可見光的波長是3900~7800Å。可見光的各種有色光能引起細胞退變，延長核分裂的間期，還可顯著降低細胞的附壁能力。因此，體外培養細胞應避免日光直接照射，最好在黑暗中進行培養或短期存放。

(二)紫外線

弱紫外線下耐受能力強的細胞變化不大，但對敏感的細胞有損害。紫外線強時，新分離的細胞顯示：不能進行完全的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮；在有絲分裂時細胞質的起泡減少。Elrlich腹水癌細胞經紫外線照射后，用飛點紫外線顯微鏡觀察發現被照射表面形成水泡，隨後細胞膨脹，損害也漸變嚴重。

(三)放射線

X射線對細胞有明顯損傷。β射線可影響細胞核的分裂。γ射線使核分裂數減少並出現不正常的核分裂，可使細胞死亡。

(四)超聲波和振動

在超聲波振動下，細胞很快會破裂，開始是胞質發生紊亂的流動，原生質膠體結核也有明顯變化，若停止超聲波振動可回復。細胞致死的原因是由於產生空化作用所致。當超聲波在2.5W/cm2時，細胞受損，染色體發生畸變，首先發生畸變的是核染色體。

在體外培養細胞中，細胞接種數對細胞的生長有影響，適宜的接種密度，可以促使細胞增殖，接種密度太低或太高都不利於細胞的生長增殖。如果培養液與細胞的容積比例大於2000:1，生長物質彌散到細胞外的比例將是細胞內達到低於最小限度的濃度，此時細胞不能再增殖，培養液中的pH變鹼，抑制細胞生長，細胞變圓不能貼壁，甚至引起細胞死亡等。如果接種密度太高，每個細胞周圍培養液的容積降至0.007mm3以下，由於彌散率的降低，細胞內生物質的濃度增加，容易使排除物或其他代謝產物達到飽和，能量來源也很快耗盡，因此也會妨礙細胞的增殖。

如何選擇適宜的接種濃度要根據細胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定。一般來說，細胞代謝旺盛、生長速度快的細胞如腫瘤細胞，接種濃度宜偏低；而正常組織細胞生長較慢，代謝不夠旺盛，接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用，接種濃度可偏低些；有時為了便於觀察細胞形態結構，接種濃度也可適當降低。

七、容器轉動速度和懸浮攪動速度

有時為了研究的需要而將培養細胞在容器中進行旋轉或攪動，如貼壁細胞在旋轉管中培養，使轉鼓的轉速提高，細胞增殖率隨之提高。其原因可能是轉動使足夠的營養流動和較充分的氧化作用之故。

當懸浮攪拌培養細胞時，攪拌速度既不能太快，也不能太慢。如太慢，細胞易結團、下沉和貼壁，不利於細胞在懸浮狀態下增殖。如果太快，容易起泡沫，細胞易窒息致死，同時，強烈地攪動易使細胞因機械損傷而破裂。所以選擇適宜的攪拌速度很重要。如BHK21的攪拌速度適宜為460~330r/min；淋巴細胞(Raji)株，在200 r/min 和400 r/min 時細胞數不增不減，或稍有下降，而攪拌速度增加到600 r/min時出現生長；類淋巴細胞(Namalva)生長速度快，在80~100 r/min 時既不結團，又不需加抗泡沫劑，且細胞生長仍然很快。各種細胞的適宜攪拌速度不一致，通常與細胞的特性和質量有關，予以注意。

我們知道，人體的生長發育依靠的是生長激素，但科學家研究結果證明：人的腦垂體分泌的生長素在體內只能存在2分鐘左右，經過血液，到達肝臟后迅速轉化為生長因子。因此，在研究過程中，只能檢測到血液中的生長因子，而檢測不到生長激素。同時證明：生長因子隨著年齡的增長逐漸減少，人體表現出各種衰老癥狀。

1、對骨骼系統的作用：促進生成大量的成骨細胞、抑制破骨細胞。治療骨質酥鬆、股骨頭壞死、關節炎、風濕病和因鈣缺乏導致的疾病。

2、對消化系統的作用：加強胃腸功能，促進消化酶的分解，增進食慾，治療慢性胃炎。

3、對血液系統的作用：加強骨髓造血功能，促進幹細胞生成，進而生成大量紅細胞和白細胞。加強左心室厚度，增強心肌彈性力，高效治療心臟病。有效清除血液中低密度蛋白，防止在血管壁沉積，治療血栓。

生長因子是人體自身細胞產生的。

人體內各種各樣的生長因子能夠促進細胞的生長、修復並補充營養。當人體組織由於受傷、疾病或衰老的原因而遭受損害時，人類生長素即刺激生長因子產生，這些生長因子即像消防隊一樣趕去“救火”。杜幫博士說，如果比喻“人類生長素是將軍，生長因子就是基層的士兵，在組織內本土進行戰鬥”。

細胞生長因子是一種多功能強力細胞因子，對促進成纖維細胞的代謝和膠原蛋白的形成發揮著重要功能。細胞生長因子能促進皮膚組織的生長繁殖，它通過與細胞表面特異受體結合，調控皮膚上皮，內皮和基質細胞的分裂、繁殖和生長分化，促進細胞代謝，增強氧化作用；能促進與皮膚損傷有關細胞的迅速生長繁殖，並調節細胞間基質的合成、分泌及分解；能促進角質層細胞的再生，加速皮膚角質層和基質層的修復，促進人體皮膚細胞的生長；能增強皮膚細胞的蛋白質的合成和細胞代謝，具有延緩皮膚細胞衰老、促進表皮細胞的修復和生長作用，使皮膚光滑豐潤。

細胞生長因子其PH值為5.8，與人體皮膚的酸鹼度一致，能有效保持皮膚的微酸性環境，防止細菌生成。與bFGF（鹼性成纖維細胞生長因子）和hEGF（表皮細胞生長因子）相比，後者長期使用會造成皮膚髮黃，並且修復深度有限。

細胞生長因子功能強大，具有深層修復作用，再現代臨床醫學及外科手術和美容手術中發揮著不可估量的巨大作用。