成骨細胞

在不同成熟時期，成骨細胞在體內表現為4種不同形態，即前成骨細胞(preosteoblast)、成骨細胞(osteoblast)、骨細胞(osteocyte)和隊形細胞(bonesliningcell)。前成骨細胞是成骨細胞的前體，由基質幹細胞分化，沿著成骨細胞譜系發育而成，位於覆蓋骨形成表面的成骨細胞的外側。成熟的成骨細胞是位於骨表面的單層細胞，承擔著合成骨基質的重要功能。

骨細胞是在成骨細胞系譜中成熟和終極的分化細胞。骨細胞包埋於礦化骨組織中，淺表骨細胞仍然保留部分成骨細胞結構。隊形細胞是排列於成體大部分骨表面的一層形態扁平或呈長方形的細胞。活躍的成骨細胞為梭形、錐形或立方形，胞漿嗜鹼性。細胞核位於細胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細胞連接。電鏡下胞漿內具有典型的蛋白合成結構——豐富的粗面內質網及核糖體，高爾基體較發達。

在生物化學和組織化學上，成骨細胞富含鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)，並有糖元存在。成骨細胞可被不同種類的激素(如甲狀旁腺激素和前列腺素E2)及生長因子(如胰島素樣生長因子、轉化生長因子-β、骨形態發生蛋白)激活，提高胞漿cAMP的水平，刺激DNA和膠原的合成(Aronow等，1990)。

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。人類及動物體骨組織不斷地進行著重建，骨重建過程包括骨的分解吸收與新骨的形成。破骨細胞負責骨分解與吸收，而成骨細胞負責新骨形成。破骨細胞貼附在舊骨區域，分泌酸性物質溶解礦物質，分泌蛋白酶消化骨基質，形成骨吸收陷窩；其後，成骨細胞移行至被吸收部位，分泌骨基質，骨基質礦化而形成新骨。破骨與成骨過程的平衡是維持正常骨量的關鍵。

成骨細胞在骨形成過程中要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡4個階段(童安莉等，1999)。在體外培養系統中成骨細胞表型發育與其體內的發育分化較相似，都要經歷細胞增殖、細胞外基質成熟和基質礦化3個時期。Ⅰ型腔原和一些非膠原蛋白是成骨細胞分化的標記物，能反映成骨細胞分化表型特徵。

成骨細胞的來源主要有骨、骨膜、骨髓及骨外組織。及人的胚胎顱骨或新生動物的顱骨為成骨細胞的常用來源。Robey(1985)採用膠原酶處理松質骨骨塊以除去結締組織和骨髓造血組織，再將處理過的骨塊進行培養來獲得更純凈的成骨細胞。將人胚胎顱骨中所獲得的成纖維樣細胞通過加入β-甘油磷酸鈉誘導分化后培養3周，可見細胞基質鈣化，表明所得細胞為具有很強分化能力的成骨細胞。將以乙二胺四乙酸和膠原酶消化胎兒顱骨獲得的細胞進行體外培養，發現其在人工材料上能持續增殖20倍以上，且具有高ALP活性。取人松質骨建立成骨細胞體外培養模型並得到了大量純化的成骨細胞。選用成年雌性大鼠松質骨在較短時間內得到較多數量的成骨細胞。骨膜中的細胞早已被證實在適當的條件下可形成骨和軟骨。Vacanti等(1993)從新生小牛肩胛骨骨膜中分離出成骨細胞並種植到多孔聚羥乙酸支架上，7～10d后成骨細胞發生增殖。

用膠原酶短時預消化法從取自紐西蘭兔脛骨上端內側面骨膜上短時間內得到高純度的成骨細胞。骨髓分造血和基質兩大系統，其成骨能力來源於基質。張銀剛等(2000)採用胎兔長管骨骨髓細胞進行體外培養，證明其有骨細胞系特性，可作為修復骨缺損的種子細胞。周皮細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、成肌細胞都曾有過向成骨細胞轉化的報道。

成骨細胞分化過程受遺傳因素、激素水平及細胞調控因子的影響與調控。對成骨細胞增殖的調控主要是通過對細胞周期的調控，即對細胞在有絲分裂原作用下複製DNA和細胞分裂進行調節。以下將對激素水平及細胞調控因子對成骨細胞的增殖與分化的影響進行闡述。

核結合因子-α1(CBF-α1)由成骨細胞特異性表達，是決定成骨細胞分化的因子，其調控的成骨細胞分化途徑是不可替代的(Tou等，2001)。CBF-α1是骨形成的關鍵基因，決定著成骨細胞的發生與分化，它在維持正常的骨骼生長發育中起著重要作用(David等，2000)。

研究結果已證明CBF-α1除調節成骨細胞分化外，還調節已分化成骨細胞的功能和其它生長因子的基因表達，從而控制出生后骨骼形成和發育的生理過程(Tamara等，2001)。CBF-α1不僅對成骨細胞分化起著特異的調控作用，在軟骨生成和軟骨內骨化過程中也發揮著不可或缺的作用。CBF-α1轉錄因子及其對成骨細胞定向分化的調控已廣為人們認識和接受，但CBF-α1基因表達調控及其誘導成骨細胞分化的分子機制有待進一步探索。

Ogawa等(1993)最先從小鼠纖維細胞克隆得到CBF-α1/p56的cDNA，並發現其在T淋巴細胞株、NIH3T細胞、胸腺和睾丸組織中表達。Duey等(1998)研究發現，在小鼠交配后12.5d的胚胎髮育期，發現較高的CBF-α1mRNA表達在顱骨、中軸骨及四肢骨間充質細胞聚集區，這些細胞是能分化成成骨細胞及成軟骨細胞的雙能前體細胞。然而，CBF-α1的過高表達也可刺激破骨性骨吸收。Xiao等(1999)分析了小鼠、大鼠和人的CBF-α1基因結構及3種CBF-α1亞型的表達，結果發現Ⅱ型CBFα1表達於所有物種的成骨細胞中，Ⅲ型CBF-α1表達於小鼠和大鼠而並非人的成骨細胞中。因此，Ⅱ型CBF-α1在成骨細胞的分化過程中可能起著更重要的作用。Komori等(1997)用基因敲除小鼠模型，發現CBF-α1基因敲除的雜合子小鼠出生時骨發育明顯受阻，表現出和人的鎖骨顱骨發育異常綜合征相似的臨床癥狀。而CBF-α1基因敲除的純合子小鼠出生時無成骨細胞和骨組織形成。Lengner等(2002)在轉基因小鼠研究中發現，CBF-α1的過高表達，使成年鼠成骨細胞的成熟受到影響，骨形成及骨吸收均增加，骨代謝轉化增強，骨礦化降低。Clark等(2004)在骨損傷點中置入含CBF-α1質粒的Ⅰ型膠原海綿，發現質粒置入組的恢複比未置入質粒組快，且有明顯的軟骨形成、在骨損傷傷口邊緣可見活性成骨細胞，而對照組傷口邊緣活性成骨細胞較少，無新骨形成，提示局部運用CBF-α1可促進骨損傷的恢復。

近年來，隨著維生素D在骨代謝疾病方面的研究和應用不斷深入，發現維生素D具有調節骨的微環境，影響骨細胞的功能。維生素D是一種具有多種生理功能的類固醇激素。1.25(OH)2D3是維生素D最具活性的代謝產物，主要作用於成熟的細胞。研究表明，1.25(OH)2D3之所以能調控成骨細胞的功能，主要是通過受體介導的基因途徑即VDR起作用的(Norman等，2002)。郭麗娟等(2005)研究表明，1.25(OH)2D3可刺激人成骨細胞MT1-MMP的表達，MT1-MMP能直接或間接分解未礦化骨基質，因此，1.25(OH)2D3可刺激人成骨細胞MT1-MMP表達，降解未礦化的Ⅰ型膠原等骨基質，啟動骨吸收。維生素D受體(VDR)是介導1，25(OH)2D3發揮生物效應的核內生物大分子。VDR是一種基因轉錄調節蛋白，屬於類固醇類激素受體超家族成員，位於細胞核內，是研究較廣泛的與骨代謝相關的基因之一。VDR本質上是一種依賴配體的核轉錄因子，它在維持機體鈣、磷代謝，調節細胞增殖、分化等方面起重要作用，已成為近年來骨和內分泌學領域研究的熱點(顧豐穎等，2008)。VDR不僅存在於成骨細胞，也存在於破骨細胞。位於骨組織的VDR作用是雙向的，成骨細胞上的VDR可調節位於破骨細胞上的VDR，可抑制其增殖亦可促進其分化，從而對骨的合成和分解代謝起著雙向調節作用(顧豐穎等，2008)。位於成骨細胞上的VDR可促進骨橋蛋白(OPN)、骨鈣蛋白(OC)的合成，參與骨的形成和礦化。OPN是成骨細胞分泌的一種基質蛋白，對細胞的黏著和遷移非常重要。1.25(OH)2D3與VDR結合，誘導破骨細胞移向骨基質表面，與OPN結合，清除老化的骨組織，合成新的骨組織。OC主要由成骨細胞合成分泌，是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，OC大部分沉積在細胞外骨基質，新合成的小部分釋放入血循環，OC在血清中的含量與成骨細胞合成的總量呈正相關，可特異反映成骨細胞的活性，是反映機體骨更新狀態和骨形成的特異指標，具有調節礦鹽結晶生成，促進骨基質礦化的作用。

降鈣素是由甲狀腺C細胞分泌的多肽類激素，它是維持體內鈣磷代謝的重要激素，降鈣素通過抑制破骨細胞活性和數量，促進成骨細胞的形成而參與骨代謝(張永莉等，2005)：近年來被廣泛地用於治療以急性或慢性骨丟失為特徵的疾病，如變形性骨炎、老年性骨質疏鬆症、高鈣血症和惡性骨質溶解症等。降鈣素是強有力的破骨細胞抑製劑，可直接、快速而廣泛地抑制骨吸收。研究結果顯示，降鈣素不僅作用於破骨細胞，對成骨細胞也有直接作用(肖永華等，2002)。早在1991年，Farlry等研究發現降鈣素可直接作用於人成骨細胞，刺激成骨細胞增殖和分化，推斷降鈣素可能是促進成骨細胞增殖、分化、礦化能力增強的主要因素之一。Kobayashi等(1994)研究結果顯示，降鈣素可直接作用於小鼠成

骨細胞(MC3T3E1)，刺激小鼠成骨細胞胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、fos腫瘤基因(c-fos)、Ⅰ型膠原和骨鈣素mRNA表達，刺激小鼠成骨細胞增殖和分化。Drissi等(1997)研究顯示，人成骨肉瘤細胞和人成骨細胞可表達降鈣素和外源性降鈣素相關肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)。降鈣素對體外培養大鼠成骨細胞的增殖、分化和礦化功能具有刺激作用，也可阻止成骨細胞的凋亡(朱建民等，2001)。而對CGRP的研究結果顯示，外源性降鈣素可增加成骨細胞集落的數目和大小。廉凱等(2002)用CGRP培養液培育SD大鼠頭蓋骨來源的成骨細胞，結果證實外源性CGRP可促進成骨細胞增殖，並呈劑量依賴性。Imai等(2002)用基因重組方法培育出成骨細胞能分泌大量CGRP的轉基因大鼠，結果發現成骨細胞活性大為增強，骨合成明顯超過骨吸收，使骨容積較野生型對照組明顯增加，並且進一步說明成骨細胞可通過自分泌CGRP的方式增強自身及周圍細胞的活性，CGRP不只是作為一種神經遞質發揮作用。但是CGRP是如何參與到成骨細胞正常的代謝中，其發揮作用的具體機理尚需要進一步的研究。

轉化生長因子-β(TGF-β)是成骨細胞中含量較多的生長因子，成骨細胞本身可以合成TGF-β，而且在成骨細胞的細胞膜上有TGF-β的特異性受體。TGF-β可以作用於成骨細胞，調節其增殖和分化(盧衛忠等，2000)。轉化生長因子-β(TGF-β)家族包括TGF-βs、骨形態蛋白2-7(BMPs2-7)、肌動蛋白(actin)和抑制素(inhibitin)。TGF-β是骨代謝的一種重要局部因子，可刺激多種骨組織細胞的增殖分化，TGF-β合成初期是一種無活性的大分子複合物，骨基質中有大量的無活性TGF-β，當pH降低或纖溶酶及組織蛋白酶激活時，可使無活性的TGF-β活化，調節骨吸收區新骨的形成。TGF-β刺激非轉化的成骨細胞的DNA合成及細胞增殖。TGF-β異構體TGFβ1、TGF-β2、TGF-β3在調控成骨細胞因子分泌、細胞外間質生成及細胞成熟等方面可能發揮不同的功能(Fagenholz等，2001)。TGF-β還是一種強有力的成骨細胞趨化因子，可使成骨細胞由TGF-β低濃度向TGF-β高濃度區域移動、聚集，並可使遷移的細胞數目增加4倍(Lind，1998)。體內試驗表明，TGF-β有較強的成骨和成軟骨作用。Noda等(1989)首次運用外源性TGF-β直接注射鼠和兔的顱骨發現，TGF-β對骨形成具有明顯促進作用，骨生成量明顯增加。Marcellic等(1996)研究發現，注射在鼠股骨骨膜下的TGF-β誘導骨膜間充質細胞分化為成骨細胞和軟骨細胞，並刺激這些細胞的增殖和具有骨及軟骨特徵性的細胞外基質蛋白的合成。Richards等(1999)研究發現，在試驗兔脛骨上進行的牽張，可使牽張區中的成骨細胞增殖活躍，成骨能力增強。對成骨樣細胞的培養發現TGF-β對成骨樣細胞具有直接的、強有力的趨化作用，因此，在牽張成骨過程中TGF-β的增加對於間充質細胞和成骨細胞的遷移可能是一個重要的調節因素。

骨形態發生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)是比較受關注的與骨誘導有密切關係的一種骨生長因子，是骨修復中最主要的誘導修復因子。BMP是公認的高效骨誘導因子，廣泛存在於人和動物的骨組織中，但主要聚集在骨幹的皮質骨中。它是由人和動物的成骨細胞和瘤性成骨細胞產生，隨著骨改建進程擴散進入松質骨和骨髓。BMP具有誘導成骨細胞分化和誘導體外成骨能力(Chen等，1997)。骨形態發生蛋白是轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員，是一類家族物質，為止至少有15種BMP已被發現。Urist(1965)最早利用脫鈣骨基質在肌肉內誘發異位成骨，這一試驗結果提示在骨基質中可能含有一種活性蛋白，這種活性蛋白具有使未分化的間充質細胞定向分化為成骨細胞並形成骨組織的能力，它就是後來被命名的BMP。隨著分子生物學和基因工程的發展，到1996年已發現到BMP-13，並已獲得了相應的cDNA克隆。在BMP213中，有關BMP-2的成骨作用研究的報道最多(Wzney等，1998：Cleste等，1990：Qaynak等，1990：Oaynak等，1992)。在體和離體試驗結果都證明BMP-2有促進成骨細胞分化和誘導體外成骨的能力(Chen等，1997)。BMP-2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一，通過激活Smads信號傳導和調節成骨基因轉錄而發揮其成骨作用。有研究發現(Liu等，2007)，BMP-2可上調66種基因表達，其中包括Smad6、Smad7、Msx2等13種相關轉錄因子。Gazzerro等(1999)發現BMP-2可降低細胞內膠原酶11mRNA的表達從而降低成骨細胞表達膠原酶，有利於基質的合成。Hay等(1999)在人新生成骨細胞前顱蓋骨細胞(HNC)中，加入重組人BMP-2(50μg/L)，連續培養3～7d，可影響不成熟的HNC細胞，增強其ALP活性。在第2周時，基質礦化明顯增加，在第3周時骨鈣素mRNA和蛋白水平及鈣在基質中的含量增加，提示成骨細胞完全分化。劉銘等(2006)發現局部注射BMP-2可顯著提高老年大鼠股骨上端局部皮質厚度、骨密度及骨力學強度。此研究也表明了BMP-2在成骨過程中有重要作用。成骨細胞的研究依然是一個熱門話題，如在骨組織工程學中的研究，醫學上防治骨質疏鬆症的研究等。但是也存在著很多問題，許多研究還只是初步探索階段，還需要系統、深入的研究，相信成骨細胞會有非常好的應用前景。