辣根過氧化物酶

過氧化物酶，酶學分類號為EC 1.11.1.7。

Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O。

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）比活性高，穩定，分子量小，純酶容易製備，所以最常用。HRP廣泛分佈於植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同工酶組成，分子量為40,000，等電點為PH3～9，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶於水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右（最高可達3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。

1） RZ>3 活性 >250u/mg，主要應用於免疫學，是高純度的過氧化酶。採用特殊色譜純化技術以除去會影響免疫學反應的同工酶B .

2） RZ>2 活性 >180u/mg ，主要應用於臨床化學，我們的客戶也有將這個規格的產品應用於免疫學研究的。此時，一個標準化的分析方法就變得尤為重要。

3） RZ>1 活性 >100u/mg，主要應用於血糖試紙和尿液分析試紙。

4） RZ>0.6 活性 >60u/mg ，主要應用於尿液分析試紙。

過氧化物酶催化以下反應：

2 H2O2 →O2+2H2O

這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質類（hemeProteins）。過氧化物酶在生物界分佈極廣，在細胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。

本實驗是以辣根為原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冷凍乾燥，最後製得高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶分子量在40，000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，等電點7.2；易溶於水，溶解度為5%(W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶於0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0（對愈創木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內保持穩定，加熱到63℃后15分鐘內穩定。

辣根過氧化物酶氧化還原電勢很低，pH6.08時，E’0= -0.2070v；pH為7.71時，E’0= -0.5787v。

辣根過氧化物酶的作用機理可分以下幾步：

第一步，形成綠色有活性的酶一底物複合物Ⅰ：第二步，複合物Ⅰ轉變成紅色有活性的複合物Ⅱ：

複合物Ⅰ+AH→複合物Ⅱ+A

第三步，複合物Ⅱ被還原，釋放出酶： AH：表示還原型氫供體。

在一定程度上複合物Ⅱ可自發地分解成HRP和產物（P），亦可與過量的過氧化氫形成無活性的複合物Ⅲ。

辣根過氧化物酶的活力測定方法有多種，主要原理介紹如下：

1、Rz值，提純工作的後幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。

403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質的吸收，結晶的HRP的Rz值為3.04。測定時的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。

2、愈創木酚法：測k4[見反應式⑶]。以愈創木酚（鄰甲氧基酚，guaiacol）為氫給體，其反應如下：

四鄰甲氧基連酚有色產物四鄰甲氧基連酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）與底物過氧化氫以及氫供體愈創木酚的濃度有關。方程如下：

e—酶濃度；

α0—氫供體起始濃度；

x0為過氧化氫的起始濃度。

如果測定的條件選擇成k4α0》k1x0，可以測得k1：

所以 所以：

—測定過程中底物減少的速度。

本實驗是採用測定k4的方法來判斷酶的純度。

上述測定Rz值和k4值的方法雖然比較簡單，但都不能測得酶的實際活力單位。測定過氧化物酶的傳統方法是連苯三酚試驗法，以過氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形成紅棓酚（Purpurogallin），在430nm處測定產物的形成。用紅棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在標準測定條件下1毫克酶所形成的紅棓酚微克數。

儀器

離心機、乾燥器、分光光度計。

試劑

⒈ 硫酸銨：工業純和化學純；

⒉ 丙酮。

⒊ 10mM pH7.0磷酸鹽緩衝液：稱取243.5毫克磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），溶於400毫升水中。

⒋ 20mM愈創木酚溶液：取0.22毫升愈創木酚加水至100毫升。

⒌ 40mM過氧化氫溶液：取0.4毫升30%過氧化氫加水至100毫升（如測k1則用10mM過氧化氫溶液）。臨用前配製。

⒍ 5%乙酸鋇溶液

⒎ 奈氏試劑

⒏ 0.1 mol/L硝酸銀溶液

（一）HRP的製備

⒈水提取：

稱取 10斤用水沖刷乾淨的鮮辣根（辣根皮中亦含有豐富的HRP），用菜刀切成小碎塊，在攪肉機中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過夜（亦可採用高速抽提法）。次日用甩干機（或離心機）甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次，合併兩次濾液，量總體積和度，0。

⒉硫酸銨分級分離：

在不斷攪拌下，每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末（相當於0.40飽和度），大約在1~2小時內加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面渾濁液以3000轉/分離心15分鐘，棄沉澱，合併上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末（0.8飽和度）隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉澱部分在冰凍離心機中以13000轉/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉澱。將沉澱懸浮於100~150毫升蒸餾水中（加水量要使沉澱全部溶解為止），分裝於透析袋內，放在流動自來水中進行透析1~2天，直到硫酸銨透析完畢為止（可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查）。然後改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1 mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。

將透析液合併，在冰凍離心機中以 4000轉/分離心 15分鐘；去沉澱，量上清液的體積。

⒊丙酮分級分離：

將上清液倒入燒杯並置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4，000/分離心15分鐘，棄去沉澱。上清液再加入0.8體積（按原上清液體積）-15℃丙酮，（操作同上），靜置后，在冰凍離心機中離心收集沉澱。將沉澱溶於少量蒸餾水中，透析除丙酮。可得Rz值近於1的酶溶液。

⒋精製：

將上步酶液適當稀釋，滴加1M硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10-3M，5000轉/分離心10分鐘，得上清液。再將沉澱用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合併，分裝於透析袋內，對水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冷凍乾燥（約得20毫克），產品呈米黃色纖維狀鬆軟物，HRP產品的Rz值可達3.0左右，置真空乾燥器中低溫保存。

（二）HRP的活力測定

⒈活力測定：測定k4值的方法操作如下：

取2個比色池（帶蓋，光程1厘米），按下表加入反應物

*酶液：將1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸鹽緩衝液稀釋10倍后應用。

加好反應物，搖勻，在470nm 讀出OD值，為t=0 的讀數。立即加0.01毫升40mM過氧化氫溶液於2個比色池中，即刻搖勻並記時，每隔30秒鐘讀數一次，約5分鐘。並記下實驗時的室溫。

將所測樣品的OD值減去相應時間對照的OD值，然後以OD值為縱坐標，時間為橫坐標作圖。得一直線，計算出平均每分鐘光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式⑻求出k4值。實際的實驗值k4 = 2.2×10，k4 = 3.1×10，而k4 應當為3.3×10。該方法用於測定粗的無細胞提取液誤差較大。

因為某些物質可干擾四鄰甲氧基連酚的形成。

或不求k4值，而把在上述條件下，每分鐘OD470增加0.001所需酶量定為1個HRP活力單位。

⒉蛋白質含量的測定：

將酶液適當稀釋后，用 Folin一酚試劑法比色測定蛋白質含量。