化學發光劑

一種物質由電子激發態回復到基態時，釋放出的能量表現為光的發射，稱為發光 (luminescence)。根據形成激發態分子的激發能可將發光分為三種類型：光照發光、生物發光和化學發光。

酶促反應的發光底物

酶促反應的發光底物是指經酶的降解作用而發出光的一類發光底物，目前化學發光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP）。HRP的發光底物為魯米諾或其衍生物和對-羥基苯乙酸。AP的發光底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。

（1）.魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應在鹼性緩衝液中進行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris緩衝液作底物液。要注意是：首先，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發發光，而在最後光強度測定中造成空白乾擾，因而宜分別配製成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合；其次, HRP發光增強劑如某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶可增強HRP催化魯米諾氧化的反應和延長發光時間，提高發光敏感度。

（2）.對-羥基苯乙酸（HPA)。對-羥基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚體（熒光物質），在350nm激發光作用下，發出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。

（3）.AMPPD。 AMPPD在鹼性條件下，被ALP酶解生成相當穩定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發出波長為470nm的持續性光，在15min時其強度達到高峰，15-60min內光強度保持相對穩定。

（4）4-MUP。 4-MUP被ALP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發光的作用下，發出448nm的熒光，用熒光光度計進行測量。

直接化學發光劑

直接化學發光劑不需酶的催化作用，只需改變溶液的pH等條件就能發光的物質，如吖啶酯（acridinium, AE）在有過氧化氫的稀鹼溶液中即能發光。

電化學發光劑

電化學發光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發出光的物質。化學發光劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖16-7）和電子供體三丙胺（TPA）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發生氧化反應。二價的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價，成為強氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+，它很不穩定，可自發地失去一個質子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強的還原劑，可將一個高能量的電子遞給三價的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發態的[Ru(bpy)3]2+.。激發態的三聯吡啶釕不穩定，很快發射出一個波長為620nm的光子，回復到基態的三聯吡啶釕。這一過程可在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，使光信號增強。