northern印跡雜交

 印跡雜交吸印印跡雜交吸印類似，甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得並不牢固，所以在轉印後用低鹽緩衝液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之後將標記物切下、上色、照相，樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml

.mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要儘可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。

甲醛凝膠泳吸印。

<1>試劑：

10×MSE緩衝液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。

5×載樣緩衝液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風櫃中操作，pH高於4.0。

20×SSC；

去離子甲醯胺；

50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/L Tris，pH7.5。

<2>步驟：

40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩衝液，11.5ml

甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。

使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩衝液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲醯胺10ml。

55℃加熱15min，冰浴冷卻。

加2ml5×載樣緩衝液。

上樣、同時加RNA標記物（同位素（32P）dCTP）。

60伏電泳過夜。

取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

20×SSC洗膠1h。

20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。

取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。