多肽合成儀

固相合成法的誕生

多肽合成研究已經走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由於當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用苄氧羰基(Z)來保護α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發展。到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為後來的固相合成方法的出現提供了實驗和理論基礎。

1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現就由於其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且帶來了多肽有機合成上的一次革命，並成為了一支獨立的學科——固相有機合成(SPOS)，為此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反覆的篩選，最終屏棄了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用於保護α-氨基並在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發明了第一台全自動多肽合成儀，並首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用於保護α-氨基，其在鹼性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全，而且由於其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，並仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護基，包括合成環肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。

多肽合成儀的誕生

多肽固相合成技術的發明同時促進了肽合成的自動化。世界上第一台真正意義上的多肽合成儀出現在1960年代末至1970年代初期，它是利用氮氣鼓泡來對反應物進行攪拌，用計算機程序控制來實現有限度的自動合成。即為後來總結歸納出的第一代多肽合成儀。雖然在攪拌方式和其他各項功能方面有著明顯的缺陷，但是它畢竟把人從實驗室里解放出來，極大地提高了工作效率，所以受到了多肽科學家的一致讚揚。

多肽合成儀的問世大大促進了多肽科學的發展。反過來，隨著多肽科學的發展，科學家也對合成儀提出了更高的要求，從而帶動了合成儀的發展。目前多肽合成儀品種繁多，從合成量上分，可分為微克級的，毫克級的，克級的和公斤級的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產型的和GMP生產型的；從自動化程度上分，可分為全自動的，半自動的和手動的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術角度上分，可分為第一代的，第二代的，和第三代的；等等。

第一代多肽合成儀

第一代多肽合成儀產生時間為上世紀六十年代末至七十年代初。

代表產品是Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer和Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer。如今該兩家公司均以放棄了多肽合成儀的研發與生產，我們只能在早期的學術文獻中找到其設計原理與研究情況。雖然隨著生產工藝的改進和發展，第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發而來，第一代的多肽合成儀為之後的合成儀研發與製造產生了重大意義。

第二代多肽合成儀

第二代多肽合成儀誕生在上世紀八十年代。

代表產品是Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90。標誌性特點是溫和反應法合成多肽，一般可分為單純氮氣鼓泡和搖動式兩種。PS3 的設計原理是採用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會“抱團”，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除后要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓力會把多肽-固相載體“吹”到反應器液面上方。由於多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反應“死角”的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發，液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。　ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。

第三代多肽合成儀

第三代多肽合成儀誕生在上世紀九十年代

代表產品是美國Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336無死角多肽合成儀。ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正做到了無死角。由於攪拌速率可達每分鐘1800轉的高速，反應得以充分完全。由於無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場后最後一款儀器）至今在世界上還佔有著很大的比例。當然，ABI產品的售價也是最高的。由於部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。

CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其採用了氮氣鼓泡反應方式的優越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現。

多肽合成儀的現狀

進入二十世紀以來，各大合成儀製造公司相繼推出了升級產品和新產品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將“簡訊通知”功能融入產品，增添了用戶與設備之間的緊密感，更加人性化；C S Bio公司對其從研髮型到生產型設備的UV Online Monitor系統配置統一升級，用戶可直觀看到每一部氨基酸偶聯反應的狀態並可根據數據調整出最佳合成效果與工藝；而Intavis則進一步將UV監測功能提升，可以在整個多肽合成反應中不間斷監測多肽反應液的UV吸收信號，同時其軟體可以根據儀器監測到的信號自動優化氨基酸脫保護及交聯和清洗步驟的參數，極大的提升了合成難度高的多肽合成率；Advanced ChemTech公司自2005年破產重組後分裂為兩家新公司，其中Aapptec延續了其前身的生產步驟，推出Focus XC三通道合成儀。美國另一家公司CEM以蛋白質有機反應設備的製造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡單的小分子多肽。其採用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍。可惜的是在加熱的情況下副反應也相應增多，多肽純度不能與之前的第三代甚至第二代產品媲美。另外，微波加熱方法無法放大，故不適合用作多肽藥物的研發。

多肽合成儀以固相合成為反應原理，在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生，參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是遊離的，並且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由於Fmoc比tBoc存在很多優勢，現在大多採用Fmoc法合成，但對於某些短肽，tBoc因其產率高的優勢仍然被很多企業所採用。

具體合成由下列幾個循環組成：

1）去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。

2）激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與遊離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反覆循環直到合成完成。

3）洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA）洗脫和脫保護。

反應器

數百年來，製藥業的反應器/反應釜 設備以玻璃材質最為常見，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監測，同時合成后可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質最為適用。玻璃材質的反應器在製造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國產設備都無法達到要求出現漏液漏氣現象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理

氨基酸儲罐

用來儲存氨基酸粉末或預先活化溶解好的氨基酸溶液。小型合成儀的氨基酸儲罐一般在20－40個之間以保證無人監控下的全自動縮合反應順利進行。大型合成儀根據生產規模的不同，配置也各不相同。

溶劑儲罐

用來儲存多肽合成過程中需要的有機溶液，如DMF,PIP等。

用來測量氨基酸溶液與其他試劑的合成量，需有精密型感測器設計刻度並回傳信息至電腦控制程序。因早期的恆壓法測定偏差過大且操作繁瑣，而採用此方法測定。觸發器的數量根據不同客戶的要求而定，不同的品牌也略有不同。

轉液瓶

感應器

多端觸發器自感應定量量取法，直觀、科學、相對誤差最低。代替早期的恆壓法，避免了每日進行的大量的數學運算，操作更為簡單，測定誤差值可控制在1%。

廢液桶

廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶，保證通風良好，同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況，避免溢出。

電磁閥

多肽合成儀中的電磁閥屬於敏感配件，其控制液路的串聯與閉路，在氨基酸轉移與量取，溶劑轉移與量取兩步驟中起到至關重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。

控制面板

控制面板內往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統、合成儀統一的鏈接在一起，完成多肽合成的全過程。

軟體系統

多肽合成儀的操作軟體。不同品牌合成儀所註冊的軟體也不同。

a) UV Monitor

在多肽合成儀中，在線檢測耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯效果，從而針對特定的序列做合成設置的調整，最終達到最佳合成效果。

對於不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說，UV Monitor是相當重要的。

b) 試劑檢測

沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以採用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。

固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上遊離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有遊離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。

Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶配製中的吡啶需要經過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有遊離氨基，否則說明連接完全。

科研單位考慮因素

a) 設備本身對實驗研究的幫助

①對於多肽合成化學反應，使用設備可避免人手工操作對人體的傷害(試劑腐蝕)

②由於程序化設定，可保證每步驟偶合反應的充分性以及實驗整體的穩定性

③可以合成難肽以及超長肽(製造商需要提供其使用研究型多肽合成儀合成多肽的檢測報告)

④在休息時間可以不間斷合成工作

研究型多肽合成儀需滿足循環式氨基酸添加位置多於20個，在夜間以及周末，預先配好的保護氨基酸可根據程序設置自動偶聯並替換新的位置，保證了實驗的效率，完全實現全自動。

⑤即使實驗進行了很多年，更換了很多研究人員，實驗數據還可以保存在電腦中。

b) 國際國內相關研究人員使用該多肽合成儀進行的有效研究結果

多肽合成儀的製造商應提供其公開發表的研究性論文多篇。為進行多肽合成實驗的學生們提供研究數據並使其模擬合成過程，更好的體驗機械操作多肽合成的全步驟，檢測自己的合成結果。

c) 多肽合成儀設備的專利保護對今後研究結果的影響

考慮到高等院校實驗研究的嚴密性，結合對後期研發成果的保護機制，通常採購的設備需要具有其國際專利許可，以確保實驗研究項目的順利申報。

d) 製造商的生產規模

製造商的品牌、生產規模以及其所擁有的生產資格認證，都從側面反映了其供應設備的質量、信譽以及對客戶的服務保證。

e) 價格

科研單位以選擇持久耐用、有品牌保證的多肽合成儀為主。但不排除部分國產製造商對其品牌的虛假宣傳因素，選購時應注意，進口小型設備的價格在5－10萬美金為宜，國產小型設備的價格在5－10萬人民幣為宜。科研機構購買進口設備可申請免稅。

生產企業考慮因素

參考科研單位選購小型設備的考慮因素，對於生產型企業，使用不同品牌的多肽合成儀往往還應考慮其連貫完整的設備生產線，從小型合成規模至生產型合成規模的各種設備齊全。通常大型設備可根據反應器大小判斷其合成規模，通常可在線切割的玻璃材質反應器/反應釜需達100L，可保證批量產數十公斤的多肽產品。

對於大學、實驗室等科研用戶以及需要申報新葯的生產企業來講，使用的合成設備的國際專利號以及規定內容是非常有用的信息。

ACT多肽合成儀專利：United States Patent 4746490

Activotec合成應用技術專利： IPC8 Class: AC07K104FI USPC Class: 525 5411

CEM合成技術專利：US 7,582,728

C S Bio多肽合成儀專利：US Patent 5,380,495 & 5,453,487.

C S Bio多肽合成儀反應器專利：US Patent 6320025

PTI多肽合成儀設備專利： U.S. Patent No. 5,203,368 (Symphony). No. 5,064,940 (PS3).

PTI多肽合成儀反應器專利：U.S. Patent No. 5,980,839.

Shimadzu多肽合成儀專利：United States Patent 5344613