畢赤酵母

巴斯德畢赤酵母的另一個生物學特點是，甲醇代謝所需 的醇氧化酶被分選到過氧化物酶體中，形成區域化。以葡萄糖作碳源時，菌體中只有1個或很少幾個小的過氧化物酶體，而以甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎佔到整個細胞體積的80%，AOX增至細胞總蛋白的35%-40%。因此，當在AOX基因前利用同源重組方式插入外源蛋白基因時，可獲得大量表達。同時，根據甲醇酵母這種可以形成過氧化物酶體的特性，既可利用該系統表達一些毒性蛋白和易被降解的酶類，也可用以研究細胞特異區域化的生物發生及其機制和功能，為高等動物類似的研究提供啟示。

Koichi Ogata等人於1969年首次發現了某些酵母可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長(Ogata, et a1.1969 )，此後，用甲醇利用型酵母生產單細胞蛋白作為動物飼料的潛力就引起了廣泛關注。1987年，Cregg等人首次報道了用甲醇營養型酵母表達乙型肝炎表面抗原(HbsAg隨後Philip Petroleum公司與Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就開始了畢赤酵母表達系統的合作開發。SIBIA.的研究人員分離了AOX基因的啟動子和宿主菌株，構建了載體，並開發出了相應的畢赤酵母基因操作技術，結合Philip Petroleum公司生產單細胞蛋白的發酵工藝，實現了外源蛋白的高效表達。1993年，Philip Petroleum公司將畢赤酵母表達系統的專利賣給Research Corporation Technologies公司，並委託Invitrogea公司進行有關產品銷售。

Pichia.pastoris酵母菌體內無天然質粒，所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組，將外源基因表達框架整合於染色體中以實現外源基因的表達。包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標記等。表達載體都是穿梭質粒，先在大腸桿菌複製擴增，然後被導入宿主酵母細胞。為使產物分泌胞外，表達載體還需帶有信號肽序列。

(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一；

(2)表達效率高，其表達的外源蛋白可佔總表達蛋白的90%以上，有利於目的蛋白的分離純化；

(3)在簡單合成培養基中可實現高密度培養；

(4)表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合；

(5)由於該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源，而絕大多數微生物並不能以甲醇為碳源，可以減少污染。

(1)發酵周期長；

(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危險性；

(3)篩選高產菌株需用的藥物價格比較昂貴；

(4)培養基和培養條件不成熟。

（1）細胞增殖繁衍；

（2）分批流加的過渡階段（甘油或葡萄糖）；

（3）誘導表達階段（甲醇）；

各階段碳源都為限制性基質，其補加速率的動力學模型是高效表達的基礎。

典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及3'AOX1區。當整合型載體轉化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導分泌的信號序列。

而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α交配因子(α-factor)引導序列已經成功地引導了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞內表達載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養缺陷標記。其中，GS115菌株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用於一般的酵母轉化方法。

與複製的質粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內整合可通過高遺傳黴素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產生外源基因的串聯插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉化子中進行自然篩選。得到產量高的表達菌株。另一種在轉化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而後再通過交換整合到受體染色體上。

母系統表達的蛋白一般都具有活性，所以都採用較溫和的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達的蛋白有利於純化，可用硫酸銨沉澱，然後用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進一步純化。具體的方法和操作應按所處理的目的蛋白的性質選擇。