高效毛細管電泳法
高效毛細管電泳法
毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)、高效毛細管電泳(HPCE)
柱效高，可達105～106/m
分離速度快，幾十秒～幾十分鐘
溶劑和試樣消耗極少
沒有高壓泵，儀器成本比HPLC更低
選擇性強
1807～1809年，俄國物理學家F.F.Reuss首次發現黏土顆粒的電遷移現象。
1907年，Field和Teague首次用電泳成功分離了白喉毒素和它的抗體。
1937年，瑞典科學家將人血清提取的蛋白質混合液放在兩段緩衝溶液之間，兩端加電壓，第一次分離出白蛋白和a、b、g-球蛋白。 Tiselius還製成了第一台電泳儀並進行了第一次自由溶液電泳。他因對電泳技術的發展和應用的巨大貢獻而獲得1948年諾貝爾化學獎。自由溶液電泳的分離效率受焦耳熱的限制，只能在低電場強度下進行操作，使分析時間和分離效率很低。
1967年，Hjerten最早提出了用小內徑管在高電場下進行自由溶液的電泳。
1981年，Jorgenson和Luckas發表了劃時代的研究工作，用75um內徑石英毛細管進行電泳，電遷移進樣，熒光柱上檢測丹醯化氨基酸，達到400000塊/m理論塔板數的高效率。從此跨入高效毛細管電泳的時代。
1987年Hjerten建立了毛細管等電聚焦,Cohen和Karger提出了毛細管凝膠電泳。
1988～1989年出現了第一批毛細管電泳商品儀器。短短几年內，由於CE符合了以生物工程為代表的生命科學各領域中對多肽、蛋白質(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求，得到了迅速的發展。CE是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。
毛細管電泳法和高效液相法的區別
CE和高效液相色譜法(HPLC)相比，其相同處在於都是高效分離技術，儀器操作均可自動化，且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在於：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間,CE的分析時間通常不超過30min,比HPLC速度快；對CE而言，從理論上推得其理論塔板高度和溶質的擴散係數成正比，對擴散係數小的生物大分子而言，其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級，最低可達270fl,流動相用量也只需幾毫升，而HPLC所需樣品為μl級，流動相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實現微量製備，而HPLC可作常量製備。
毛細管電泳法和普通電泳法的區別
CE和普通電泳相比，由於其採用高電場，因此分離速度要快得多；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外，其它類型檢測器均已和CE實現了連接檢測；一般電泳定量精度差，而CE和HPLC相近；CE操作自動化程度比普通電泳要高得多。總之,CE的優點可概括為三高二少：高靈敏度，常用紫外檢測器的檢測限可達10-13～10-15mol,激光誘導熒光檢測器則達10-19～10-21mol；高解析度，其每米理論塔板數為幾十萬；高者可達幾百萬乃至千萬，而HPLC一般為幾千到幾萬；高速度，最快可在60s內完成，在250s內分離10種蛋白質,1.7min分離19種陽離子,3min內分離30種陰離子；樣品少，只需nl(10-9L)級的進樣量；成本低，只需少量(幾毫升)流動相和價格低廉的毛細管。由於以上優點以及分離生物大分子的能力，使CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。當然CE還是一種正在發展中的技術，有些理論研究和實際應用正在進行與開發。
按填充物質的性狀
自由溶液電泳和非自由溶液電泳
按分離機制分類
電泳型、色譜型、電泳/色譜型
主要分離模式
毛細管區帶電泳
膠束電動毛細管電泳
微乳液電動毛細管色譜
毛細管凝膠電泳
毛細管等電聚焦
毛細管電色譜
非水毛細管電泳
電泳和電泳淌度
電泳：在電場作用下帶電粒子在緩衝溶液中的定向移動
電滲和電滲率
電滲：液體相對於帶電的管壁移動的現象
CE所用的石英毛細管柱，在pH>3情況下，其內表面帶負電，和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下，雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象叫電滲，粒子在毛細管內電解質中的遷移速度等於電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和，正離子的運動方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當於電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大於電泳流速度，故它將在中性粒子之後流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現分離。
電滲是CE中推動流體前進的驅動力，它使整個流體像一個塞子一樣以均勻速度向前運動，使整個流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質區帶在毛細管內原則上不會擴張。但在HPLC中，採用的壓力驅動方式使柱中流體呈拋物線型，其中心處速度是平均速度的兩倍，導致溶質區帶本身擴張，引起柱效下降，使其分離效率不如CE。
表觀淌度和權均淌度
分離效率和譜帶展寬
（一）理論塔板和塔板高度
同色譜
（二）譜帶展寬
1. 流型
毛細管電泳——扁平型塞子流（高柱效）
高效液相——拋物線型
2. 自熱
電流通過緩衝溶液時產生的焦耳熱
自熱導致徑向溫度梯度，因而產生離子遷移速度的徑向不均勻分佈，使譜帶展寬
管內徑小，管外徑大，可減小自熱引起的溫度差
如：內徑50um，外徑375um
EdC1/3<1500時，自熱不會引起太大的譜帶展寬和效率損失
3. 擴散與吸附
擴散：在毛細管電泳中，溶質縱向擴散是譜帶展寬的唯一因素
吸附：毛細管管壁對於被分離物質粒子的作用
陽離子溶質和帶負電的管壁的離子相互作用
疏水作用
毛細管內表面積和體積比越大，吸附的可能性也越大
毛細管區帶電泳CZE
1. 操作電壓
柱長一定時，操作電壓增加，粒子遷移加快，柱內焦耳熱增加
在一定範圍內柱效隨電壓的升高而升高，過了極點后，焦耳熱影響加劇，反而下降 n= spELd/2D
2. 緩衝溶液的種類
直接影響粒子的遷移和分離
要求：緩衝容量好、在檢測波長處吸收低、自身淌度低、與等電點相差約1個pH單位、盡量用酸性
3. 緩衝溶液的pH
影響溶質的電荷：pH低於溶質的等電點時，溶質帶正電荷；反之，帶負電荷
引起電滲的變化：在高pH下，電滲很大
4. 緩衝溶液的濃度
濃度增加，離子強度增加，改善分離
濃度增加，電滲率降低，遷移時間延長
濃度增加，導電的離子數增加，焦耳熱增加
膠束電動毛細管色譜MECC
以膠束為假固定相的一種電動色譜
在電泳緩衝溶液中加入表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑中的疏水基團可形成膠束，溶質因淌度和分配係數的不同而分離。
1. 膠束假固定相
表面活性劑：親水基+疏水基
疏水基：直鏈或支鏈烷烴
親水基：陽離子、陰離子、兩性離子基團
2.基本原理
增加了帶電離子膠束相，其具有與周圍介質不同的淌度，並且可以與溶質互相作用
導電的水溶液相是分離載體的溶劑
3.流動相
改變流動相來調節選擇性
毛細管凝膠電泳CGE
將平板電泳中的凝膠用到毛細管中作支持物進行電泳，不同體積的溶質分子在起“分子篩”作用的凝膠中得以分離。
應用：蛋白質、核苷酸、RNA、DNA片段分離和測序、聚合酶鏈反應產物分析等等。
毛細管電色譜CEC
將高效液相色譜中眾多的固定相微粒填充到毛細管（或塗漬、鍵合到管壁），以樣品與固定相之間的相互作用為分離機制，以電滲流為流動相驅動力的色譜過程稱為毛細管電色譜。
具有高效液相色譜的高選擇性
具有毛細管電泳的的高效性
毛細管柱類型：填充柱、開管柱
非水毛細管電泳NACE
非水（有機溶劑）體系中進行的毛細管電泳
在有機溶劑中加入電解質使之具有一定的導電性才能實現NACE，酸及其銨鹽是最常用的電解質
與水體系相比可承受更強的電場，在不增大焦耳熱的條件下可提高溶液中離子的濃度或增大毛細管內徑
毛細管電泳的儀器組成
基本結構：高壓電源、進樣、填灌/清洗、毛細管、溫度控制、檢測、記錄/處理。
高壓電源
電源：0～30 kV直流高壓電源
電極：鉑絲或注射器針頭
電極槽：帶螺帽的小玻璃瓶或塑料瓶（1～5ml）
毛細管柱
化學惰性、電惰性，可以透光。
聚四氟乙烯、玻璃、石英。
內徑25～75um，管長<70cm。
沖洗和平衡
進樣
毛細管直接與樣品接觸，用動力驅動樣品進入毛細管，無死體積。
1. 電動進樣
組分在電場作用下，因電遷移和電滲作用進入毛細管內。
對離子組分存在進樣偏向
2. 壓力進樣
將毛細管兩端置於不同的壓力環境中時，管中溶液即能流動，將樣品帶入
無組分偏向，選擇性差
3. 擴散進樣
利用濃差擴散，抑制背景干擾和進樣偏向
檢測
1. 紫外檢測
2. 激光誘導熒光檢測
