差速離心

分離不同大小細胞器的方法

差速離心主要是採取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低,讓較大的顆粒沉降到管底,小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉澱,改用較高的離心速度離心懸浮液,將較小的顆粒沉降,以此類推,達到分離不同大小顆粒的目的。

概述


差速離心是指低速與高速離心交替進行,使各種沉降係數不同的顆粒先後沉澱下來,達到分離的目的。沉降係數差別在一個或幾個數量級的顆粒,可以用此法分離。樣品離心時,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過不斷增加相對離心力,使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分部沉澱。操作過程中一般是在離心後用傾倒的辦法把上清液與沉澱分開,然後將上清液加高轉速離心,分離出第二部分沉澱,如此往複加高轉速,逐級分離出所需要的物質。差速離心方法較簡單,但解析度不高,沉澱係數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開,常用於其他分離手段之前的粗製品提取。
在差速離心中細胞器沉降的順序依次為:核、線粒體溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最後為核蛋白體。由於各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉澱塊中,一般重複次效果會好一些。差速離心只用於分離大小懸殊的細胞,更多用於分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

基本原理


差速離心
差速離心
物體圍繞中心軸旋轉時會受到離心力F的作用。當物體的質量為 M、體積為V、密度為D、旋轉半徑為r、角速度為(弧度數/秒)時,可得:或者(1)上述表明:被離心物質所受到的離心力與該物質的質量、體積、密度、離心角速度以及旋轉半徑呈正比關係。離心力越大,被離心物質沉降得越快。在離心過程中,被離心物質還要克服浮力和摩擦力的阻礙作用。浮力和摩擦力分別由下式表示:(2) (3)其中為溶液密度,f為摩擦係數,為沉降速度(單位時間內旋轉半徑的改變)。在一定條件下,可有:(4) 式(4)表明,沉降速度與被離心物質的體積、密度差呈正比,與f成反比。若以S表示單位力場()下的沉降速度,則 S即為沉降係數。沉降係數對於生物大分子來說,多數在秒之間。為應用方便起見,人們規定秒為一個單位(或稱1S)。一般單純的蛋白質在之間,較大核酸分 子在之間,更大的亞細胞結構在之間。

以蛋白質為例


差速離心機原理圖
差速離心機原理圖
溶液中的蛋白質在受到強大的離心作用時,如果蛋白質溶液的密度大於溶劑的密度,蛋白質分子就會下沉,在離心場中,蛋白質分子所受到的凈離心力(離心力減去浮力)與溶劑的摩擦力平衡時,每單位離心場強度定值,這個定值即為沉降係數(sedimentation coefficient)。沉降速度用每單位時間內顆粒下沉的距離來表示。

測定方法


⑴樣品:蛋白質
⑵樣品溶液與離心:將樣品溶於緩衝液中,用一定規格的雙槽分析池,一邊加入溶液一邊加入溶劑。分析池與平衡池平衡重量,使平衡池比分析池輕以內,然後分別裝入分析轉頭。抽真空。開Schlieren光光源,選擇工作速度,室溫離心。轉動腔達到真空后離以機開始運轉加速,此時在觀察窗口可以看到離心圖型。達到工作速度后恆速離心。

優點


差速離心法的優點是樣品的處理量較大,可用於大量樣品的初分離。其缺點是分離複雜樣品和要求分離純度較高時,離心次數多,操作繁雜。由於沉澱的多次清洗、溶解、再沉澱,容易引起中間損失,所以離心分辨力差。實際分離時由於離心時的對流、擴散和收取沉澱時的污染,對於一些沉降係數相差不大的組分無法進行完全的分離提純。產品的純度和回收率都達不到上述理論值。因此差速離心法主要用於大量樣品的初步分離提純。