可溶性蛋白質

可溶性蛋白指可以以小分子狀態溶於水或其他溶劑的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等實驗中作為重要指標。如可溶性蛋白是植物抗旱性的重要指標之一。

考馬斯亮藍G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。考馬斯亮藍G－250在遊離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中，當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者最大光吸收在465nM，後者在595nM。在一定蛋白質濃度範圍內(1～100μg)，蛋白質與色素結合物在595nM波長下的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G－250結合在2Min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1H內保持穩定。該反應快速靈敏(靈敏度比FolIn－酚法還高4倍)、易於操作、干擾物質少(考馬斯亮藍G－250和蛋白質通過范德華力結合，受蛋白質的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質染色強度差異不大)，可測定微克級蛋白質含量，是一種比較好的蛋白質定量法。但此方法也存在其缺點，考馬斯亮藍在蛋白質含量很高時線性關係偏低，且不同來源蛋白質與色素結合狀況有差異。

721分光光度計；10Ml量筒1個；研缽；燒杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，0?1Ml 3支；10Ml具塞刻度試管14支。

標準蛋白質溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白質100μg/Ml的標準蛋白溶液;

90%乙醇；

85%磷酸(W/V)；

考馬斯亮藍G－250溶液：稱取100μg考馬斯亮藍G－250，溶於50Ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100Ml，最後用蒸餾水定容到1000Ml，貯放在棕色瓶中，此溶液在常溫下可放置1個月。

1?標準曲線(蛋白質含量為0～100μg/Ml)的繪製　取6支具塞試管，按表2－1數據配製含0～100μg/Ml的牛血清蛋白質液各1Ml。

表2－1不同蛋白質含量的牛血清蛋白質液配製表

管號123456蛋白質標準液（ml)00.200.400.600.801.00蒸餾水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白質含量（μg）020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，蓋塞，反轉混合數次，放置2Min后，用1CM光徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪製標準曲線。

2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定　吸取樣品提取液1.0Ml(樣品提取見LoWry法)，放入具塞試管中(每個樣品設置兩個重複)，加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值，並通過標準曲線查得蛋白質含量。

3.結果計算

樣品中蛋白質的含量(Mg/g)=C×VTV1×FW×1000（2-2）

式中C：查標準曲線值(μg)；VT：提取液總體積(Ml)；

FW：樣品鮮重(g)； V1：測定時加樣量(Ml)。