Sage

. 驗線。

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，～鹼基短核苷酸序列標籤包含足夠息，足異確某轉錄。例，鹼基的序列能有四的9次方，即262144種不同的排列組合，而人類基因組估計僅能編碼80000種轉錄本，所以理論上每一個9鹼基標籤能夠代表一種轉錄本的特徵序列。

第二，如果將短片段標籤相互連接、集中形成長的DNA分子，則對該克隆進行測序將得到大量連續的單個標籤，並能以連續的數據形式輸入計算機中進行處理，這樣就可以對數以千計的mRNA轉錄本進行分析。

第三，各轉錄本的表達水平可以用特定標籤被測得的次數定量。

1.2 SAGE的實驗路線。

如圖1所示：

(1) 以biotinylated oligo(dT)為引物反轉錄合成cDNA，以一種限制性內切酶(錨定酶 Anchoring Enzyme， AE)酶切。錨定酶要求至少在每一種轉錄物上有一個酶切位點，一般4鹼基限制性內切酶能達到這種要求，因為大多數mRNA要長於256鹼基(44)。通過鏈霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3′端部分。對每一個mRNA只收集其polyA尾與最近的酶切位點之間的片段。

(2) 將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。每一種接頭都含有標籤酶(Tagging Enzyme TE)酶切位點序列(標籤酶是一種Ⅱ類限制酶，它能在距識別位點約20鹼基的位置切割DNA雙鏈)。接頭的結構為引物A/B序列+標籤酶識別位點+錨定酶識別位點。

(3) 用標籤酶酶切產生連有接頭的短cDNA片段(約9～10鹼基)，混合併連接兩個cDNA池的短cDNA片段，構成雙標籤后，以引物A和B擴增。

(4) 用錨定酶切割擴增產物，抽提雙標籤(Ditga)片段並克隆、測序。一般每一個克隆最少有10個標籤序列，克隆的標籤數處於10～50之間。

(5) 對標籤數據進行處理。在所測序列中的每個標籤間以錨定酶序列間隔，如圖1中錨定酶採用Nia Ⅲ限制性內切酶，則以CATG/GTAC序列確定標籤的起始位置和方向。圖1 基因表達系列分析(SAGE)示意 錨定酶(AE)和標籤酶(TE)是NiaⅢ、FokI X和O分別表示不同標籤的核苷酸順序 由於雙標籤體的長度基本相同，不會導致擴增的偏態性，同時數量和種類極大的轉錄物使同一種標籤連接成雙標籤體的可能性極小，這保證了克隆中的每一個標籤代表一種轉錄物在當前細胞狀態下的一個單位的轉錄產物，因此通過計算機軟體的分析能夠得到上千種基因表達產物的標籤序列以及豐裕度。

雖然SAGE技術能夠儘可能全面地收集生物組織的基因表達信息，但也不能完全保證涵蓋所有的低丰度的mRNA。另外標籤體的連接可能因接頭的干擾造成克隆所包含的標籤體過少和克隆序列末端不能高效地連入載體。Powell利用磁性生物素珠特異吸附引物，避免了接頭的干擾(Powell 1998)。

2. SAGE的優點和應用

SAGE是一項快捷、有效的基因表達研究技術，任何具備PCR和手動測序器具的實驗室都能使用這項技術，結合自動測序技術能夠在3個小時內完成1000個轉錄物的分析。另外使用不同的錨定酶(識別5～20鹼基的Ⅱ類核酸內切酶)，使這項技術更具靈活性。

首先SAGE可應用於人類基因組研究。1995年 Velculescu 等選擇Bsm F I和Nia Ⅲ分別作為標籤酶和錨定酶，使用計算機對9鹼基標籤數據進行分析並對GenBank檢索。在分析的1000個標籤中，95%以上的標籤能夠代表唯一的轉錄物。轉錄水平依標籤出現頻率分為4類：① 超過三次 共380個，佔45.2%；② 出現三次 共45個，佔5.4%；③ 出現兩次 共351個，佔7.6%；④ 僅出現過一次 共840個，佔41.8%。所以SAGE能夠快速、全範圍提取生物體基因表達信息，對已知基因進行量化分析。SAGE也能應用於尋找新基因。雖然SAGE的標籤僅包括9個鹼基，但加上錨定酶的位點序列(4個鹼基)共可確認13鹼基序列。如果一個標籤檢索已知序列時沒有同源序列，13鹼基片段就可作為探針篩選cDNA文庫得到cDNA克隆。

其次，SAGE可用於定量比較不同狀態下的組織細胞的特異基因表達。Stephen L等(1997)利用SAGE技術比較小鼠胚囊纖維細胞基因表達。小鼠胚囊纖維細胞能產生對溫度敏感的P53腫瘤抑制蛋白，就可通過SAGE分析，比較兩種不同溫度下基因表達的差異。從約15 000個分析的基因中，發現有14個基因的表達依賴於P53蛋白，有3個基因的表達與P53蛋白的失活顯著相關。Zhang等(1997)比較正常細胞和腫瘤細胞基因表達的300000個轉錄物發現：在分析的4500種轉錄物中，至少有500種在兩種細胞組織中的表達有顯著差異。

第三，由於SAGE能夠同時最大限度的收集一種基因組的基因表達信息，轉錄物的分析數據可用來構建染色體表達圖譜(Chromosomal expression map)。Victor等分析了酵母基因組的基因表達，從60633個轉錄物中發現了4655個基因(表達水平分佈在0.3～2.0/細胞)，其中1981個基因已被確認了功能，2684個還未被報道過。利用基因的表達信息與基因組圖譜融合繪製的染色體表達圖譜，使基因表達與物理結構連繫起來，更利於基因表達模式的研究。(Velculescu,1997) SAGE是基因表達定性和定量研究的一種有效工具，非常適合於比較不同發育狀態或疾病狀態的生物基因表達。

另外SAGE能夠接近完整地獲得基因組表達信息，能夠直接讀出任何一種類型細胞或組織的基因表達信息。SAGE技術的應用將大大加快基因組研究的進展，但必須和其它技術相互融合、互為補充，才能最大可能地進行基因組基因表達的全面研究。