固定化酶

酶固定化后一般穩定性增加，易從反應系統中分離，且易於控制，能反覆多次使用。便於運輸和貯存，有利於自動化生產，但是活性降低，使用範圍減小，技術還有發展空間。固定化酶是近十餘年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫藥等方面有誘人的應用前景。

發展歷史固定化酶的研究始於1910年，正式研究於20世紀60年代,70年代已在全世界普遍開展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固體材料將酶束縛或限制於一定區域內，仍能進行其特有的催化反應、並可回收及重複利用的一類技術。與遊離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了遊離酶的不足之處，呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重複使用、操作連續可控、工藝簡便等一系列優點。固定化酶不僅在化學、生物學及生物工程、醫學及生命科學等學科領域的研究異常活躍，得到迅速發展和廣泛的應用，而且因為具有節省資源與能源、減少或防治污染的生態環境效應而符合可持續發展的戰略要求。性狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數，它和線條這兩種形式主要用於工業發酵生產，如裝成酶柱用於連續生產，或在反應器中進行批式攪拌反應；薄膜主要用於酶電極，應用於分析化學中；酶管機械強度較大，宜用於工業生產。

優缺點優點

①固定化酶可重複使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。②固定化酶極易與反應體系分離，簡化了提純工藝，而且產品收率高、質量好。③在多數情況下，酶經固定化后穩定性得到提高。④固定化酶的催化反應過程更易控制。⑤固定化酶具有一定的機械強度，可以用攪拌或裝柱的方式作用於底物溶液，便於酶催化反應的連續化和自動化操作。⑥固定化酶與遊離酶相比更適於多酶體系的使用，不僅可利用多酶體系中的協同效應使酶催化反應速率大大提高，而且還可以控制反應按一定順序進行。缺點

①固定化可能造成酶的部分失活，酶活力有損失。②酶催化微環境的改變可能導致其反應動力學發生變化。③固定化酶的使用成本增加，使工廠的初始投資增大、④固定化酶一般只適用於水溶性的小分子底物，對於大分子底物不適宜。⑤與完整菌體細胞相比，固定化酶不適宜於多酶反應，特別是需要輔助因子參加的反應。⑥胞內酶進行固定化時必須經過酶的分離純化操作。

製備方法分類固定化酶的製備方法有物理法和化學法兩大類。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在於酶不參加化學反應,整體結構保持不變，酶的催化活性得到很好保留。但是，由於包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用，因此對一些反應不適用。化學法包括結合法、交聯法。結合法又分為離子結合法和共價結合法。是將酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上，使用偶聯劑通過酶表面的基團將酶交聯起來，而形成相對分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。其中吸附法和共價鍵法又可統稱為載體結合法。具體方法吸附法利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。採用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反覆使用。載體結合法最常用的是共價結合法，即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。以中國首先採用的雙功能團試劑“對位-β-硫酸酯乙碸基苯胺”偶聯載體和酶為例，載體結合的步驟如下頁反應式。此法曾先後用於3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖澱粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附於載體製備固定化酶也是常用的方法。交聯法依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶於水從而形成固定化酶。常採用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的遊離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯反應。包埋法酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法製備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，製成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青霉素醯化酶活力的菌體，可連續水解帤基青霉素，工業生產6-氨基青黴烷酸。酶經過固定化后，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青霉素醯化酶的工業應用）。

固定化酶的形式多樣，可製成機械性能好的顆粒裝成酶柱用於連續生產；或在反應器中進行批式攪拌反應；也可製成酶膜、酶管等應用於分析化學；又可製成微膠囊酶，作為治療酶應用於臨床。現在又有人用酶膜（包括細胞、組織、微生物製成的膜）與電、光、熱等敏感的元件組成一種裝置稱生物感測器，用於測定有機化合物和發酵自動控制中信息的傳遞及環境保護中有害物質的檢測。最常用的是酶膜與離子選擇電極組成的生物感測器，例如脲感測器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧電極組成，脲經脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又繼續被硝化菌氧化，總耗氧量則通過氧電極反映出電流的變化，用以計算脲的含量。