細胞復甦

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，並不時搖動令其儘快融化。2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管並滴加10倍以上培養液，混勻；3. 離心， 1000rpm，5min；4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；5. 次日更換一次培養液，繼續培養。

細胞復甦是與細胞凍存相反的過程，即是細胞恢復生長的過程，是將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細胞解凍之後重新培養。當恢復到常溫狀態時，細胞的形態結構保持正常，生化反應即可恢復。與細胞凍存不同，細胞復甦過程升溫要快，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。

①將冷凍管從液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，細胞融化后要儘快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率，復甦過程中一般細胞死亡率在20%～25%之間。

②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然後放置在冰浴上。

③小心開啟瓶蓋，把細胞轉入含有4mL培養基的培養瓶中，然後把培養瓶移至培養箱，26℃～28℃培養1h，讓細胞貼壁。

④細胞貼壁后，小心移棄培養基，主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉澱除去DMSO)、死細胞及其碎片，加5mL新鮮培養基，26℃～28℃培養。

⑤細胞培養24h后，更換新鮮培養基，繼續培養直到形成單層，便可以傳代。

⑥詳細記錄復甦細胞的名稱、數量、復甦時間、存放部位等。

判斷細胞復甦成功與否，需要看復甦后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩餘的細胞，用台盼藍染色法檢測復甦細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。如果復甦后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復甦的過程沒有問題。復甦的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性(比如細胞群體倍增時間等)后要再凍存以補充細胞儲存數量。

1、注意無菌操作。

2、應在1-2min內使凍存液完全融化。如果復溫速度太慢，則會造成細胞損傷。另外，細胞復甦后的操作最好在4℃冰浴中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。

3、細胞復甦過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃冰箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋。

4、細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管並在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，並防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球將凍存管消毒並晾乾。

5、液氮操作有一定的危險性，打開液氮罐取出細胞時，戴上防護眼鏡。

6、如果凍存管密封不嚴，液氮可被吸入。由於解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發生爆炸。復甦過程中應蓋上恆溫水浴鍋的蓋