紙層析法

以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動相為不與水相溶的有機溶劑；也可使紙吸留其他物質作為固定相，如緩衝液，甲醯胺等。將試樣點在紙條的一端，然後在密閉的槽中用適宜溶劑進行展開。當組分移動一定距離后，各組分移動距離不同，最後形成互相分離的斑點。將紙取出，待溶劑揮發后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點位置。根據組分移動距離（Rf值）與已知樣比較，進行定性。用斑點掃描儀或將組分點取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。

通常可用於葉綠素的色素成分檢驗，氨基酸的鑒定及測定，橘皮精油成分檢驗及一些特定細胞篩查等實驗。

紙層析法依據極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相。由於樣品中各物質分配係數不同，因而擴散速度不同，從而達到分離的目的。

試樣經層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點中心至色譜斑點中心的距離與原點中心至流動相前沿的距離之比），由於影響比移值的因素較多，因此一般採用在相同實驗條件下對照物質對比以確定其異同。作為單體鑒別時，試樣所顯主色譜斑點的顏色（或熒光）與供置，應與對照（標準）樣所顯主色的譜斑點或供試品-對照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點相同。作為質量指標（純度）檢查時，可取一定量的試樣，經展開后，按各單體的規定，檢視其所顯雜質色譜斑點的個數或呈色（或熒光）的強度。作為含量測定時，可將色譜斑點剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。

在環境分析測試中，有時用紙層析法分離試樣組分，它用於一些精度不高的分析，如3，4-苯並芘。但不如GC、HPLC應用普遍。在做葉綠體色素分離時用到，將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對含量和種類。

紙層析法一般用於葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿蔔素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾

紙上擴散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最後在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法

能清楚地將葉綠體中的色素分離。

紙層析法中所用的有機溶劑如丙酮等，一般有揮發性、並有一定毒性，使用時要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發物。

大試管 台天平研缽(配帶孔紙板，防止丙酮揮發) 量筒 燒杯 漏斗

軟木塞 濾紙 丙酮（可用無水乙醇替代）四氯化碳 無水硫酸鈉 碳酸鈣 石英砂

1．稱取新鮮葉子2g，放入研缽中加丙酮5ml，少許碳酸鈣(防止葉綠素被破壞）和石英砂（幫助研磨），研磨成勻漿，再加丙酮5ml，然後以漏斗過濾之，即為色素提取液。

2．取準備好的濾紙條（2×20cm），將其一端剪去兩側，中間留一長約1.5cm，寬約0.5cm的窄條，並在濾紙剪口上方摺疊出一條直線，作為畫濾液細線的基準線。

3．用毛細吸管沾少許濾液在折線上描繪4~5次，注意要畫得勻、直、細，每次畫完細線要等其自然變干后再畫第二根線。 4．在大試管中加入四氯化碳3梍5ml及少許無水硫酸鈉（即層析液）。然後將濾紙條固定於軟木塞上，插入試管內，使窄端浸入溶劑中（色素點要略高於液面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁），蓋緊軟木塞，直立於陰暗處進行層析。

經過 0.5—1小時后，觀察分離后色素帶的分佈。最上端橙黃色為 胡蘿蔔素，其次黃色為 葉黃素，再下面藍綠色為 葉綠素a，最後的黃綠色為 葉綠素b。

植物葉綠體中色素的提取與分離

用具：剪刀一把、乾燥的定性濾紙、50ml的燒杯及100ml的燒杯各3個、白紙3張、試管架一個、研缽一個、玻璃漏斗一個、尼龍布或紗布、毛細吸管一隻、葯勺一個、10ml量筒一隻，天平一隻，試管3支、紙板一塊、棉塞3個、培養皿3個、刻度尺、注射器一隻、蓋玻片

試劑：丙酮、無水乙醇、層吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸鈣、碳酸鈉

材料：新鮮的菠菜葉、青菜葉、大葉黃楊葉片

背景資料：

1、葉綠素等是脂溶性的有機分子，根據相似相溶的原理，葉綠素等色素分子溶於有機溶劑而不溶於有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時要用丙酮或乙醇等有機溶劑而不用水。

2、葉綠素分佈於基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細胞壁、質膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解於丙酮中。

3、破碎的細胞中含有草酸等有機酸，葉綠素分子中含有的Mg元素處於不穩定化合態，鎂離子與有機酸結合將導致色素分子破壞。加入少許碳酸鈣使得鈣離子與有機酸結合，減少鎂離子的轉移，防止研磨時葉綠體色素的破壞。所以在研磨時加入適量的碳酸鈣，同時加入碳酸鈉的道理亦如此。

4、在過濾時選用脫脂棉或紗布，而不用濾紙。原因主要有下：（1）色素分子比較大，不容易透過濾紙； （2）濾紙有較強的吸附性而使色素吸附在濾紙上，從而降低色素濃度，影響實驗效果；（3）葉綠素是脂溶性，根據相似相容的原理，脫脂棉可以減少實驗過程中色素的流失，增強實驗效果。

5、根據物理學中的毛細現象，畫濾紙細線前濾紙必須經過乾燥處理，是為了阻止水分子堵塞濾紙中的毛細管而影響層析液的擴散。但如果用火烤的話，會使濾紙纖維變形同時破壞毛細管，而影響層析液的擴散。

6、由於液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液面時，其邊緣的表面的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴散過快，而導致色素帶分離不整齊的現象。故而，在插入層析液的濾紙條一端剪去兩個角。

7、為了防止濾紙條倒入層析液中而使層析實驗失敗。同時，防止因液體表面張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導致色素溶解。

8、色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機溶劑如乙醇等為流動相，色素提取液為層析試樣。把試樣點在濾紙的濾液細線位置上，當流動相溶劑在濾紙的毛細管的作用下，連續不斷地沿著濾紙前進通過濾液細線時，試樣中各組份便隨著流動相溶劑向前移動，並在流動相和固定相溶劑之間連續一次又一次的分配。結果分配比比較大的物質移動速度較快，移動距離較遠；分配比較小的物質移動較慢，移動距離較近，試樣中各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達到分離的目的。