核酸電泳

凝膠電泳操作簡便、快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度離心)所無法分離的核酸片段，是分離、鑒定和純化核酸的一種常用方法。

1.原理　瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩衝液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然後倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質，其密度取決於瓊脂糖的濃度。

將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩衝液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當時間后，大小、構象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離範圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。

2.瓊脂糖凝膠電泳的儀器及試劑　儀器設備應包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時配備紫外線檢測儀和照相系統。

試劑包括瓊脂糖、電泳緩衝液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩衝液。

電泳緩衝液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0)。

溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，它可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間，在電泳過程中隨核酸片段遷移，將凝膠置紫外光下，插入核酸鏈中的EB在紫外線激發下產生紅色熒光，可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解，應存棕色試劑瓶中於4℃下保存。由於 EB是一種強的誘變劑並有中度毒性，使用時必須戴手套操作。

常用的凝膠加樣緩衝液有4種，見下表：

3.凝膠的製備和電泳

操作方法如下：

(1) 用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑料盤的邊緣圈封，製成膠模，置水平工作台上；

(2) 稱取適量瓊脂糖，置電泳緩衝液中，加熱使瓊脂糖溶解；

(3) 待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB貯存液，使終濃度達0.5mg/ml；

(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產生氣泡；

(5) 凝膠完全凝固后，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩衝液使恰好沒過膠面約1mm；

(6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩衝液混合后，加入樣品槽中；

(7) 接通電源，使樣品槽在負極端，用1-5v/cm的電壓，電泳適當時間；

(8) 電泳結束后，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，並拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘，再如上觀察和拍照，記錄結果。

4.凝膠攝影

需配置135照相機，全色135膠捲，照相機固定架，近攝鏡和紅色濾光鏡以及有機玻璃防護面罩。

操作需在暗室進行，將相機固定好，把凝膠放在紫外檢測儀上適當位置，調焦，裝上紅色濾光片，按常規拍照。

亦可使用凝膠自動處理系統，但儀器費用較高。

5.EB溶液的凈化處理

由於EB具有一定的毒性，實驗結束后，應對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環境和危害人體健康。

(1) 對於EB含量大於0.5μg/ml的溶液，可如下處理：

①將EB溶液用水稀釋至濃度低於0.5μg/ml；

②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4 ，混勻，再加入等量的25mol/L HCl，混勻，置室溫數小時；

③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH，混勻並廢棄。

(2) EB含量小於0.5μg/ml的溶液可如下處理：

① 按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時；

② 用濾紙過濾並將活性碳與濾紙密封后丟棄。

聚丙烯醯胺凝膠電泳

1.原理　聚丙烯醯胺凝膠通過丙烯醯胺單體、鏈聚合催化劑N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨以及交聯劑N，N’-亞甲雙丙烯醯胺之間的化學反應而形成。丙烯醯胺單體在催化劑作用下產生聚合反應形成長鏈，長鏈經交聯劑作用交叉連接形成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯度決定。鏈長取決於丙烯醯胺的濃度，調節丙烯醯胺和交聯劑的濃度比例，可改變聚合物的交聯度。

聚丙烯醯胺凝膠電泳可根據電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達到分離目的，兼具分子篩和靜電效應，分辨力高於瓊脂糖凝膠電泳。可分離只相差1個核苷酸的DNA片段。

聚丙烯醯胺凝膠電泳用於分析和製備長度小於1kb的DNA片段。根據所要分離的核酸片段大小，可製備不同濃度的凝膠。

2.凝膠的製備和電泳　由於氧能抑制丙烯醯胺的聚合反應，灌制聚丙烯醯胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯醯胺凝膠電泳一般採用垂直裝置。

凝膠的製備和電泳操作如下：

(1) 配製試劑

① 30%丙烯醯胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯醯胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯醯胺。

② 5×TBE　每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

③ 10%過硫酸銨：10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。

(2) 裝置膠模　將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗，並經自來水和無離子水沖洗乾淨，晾乾。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作台上，將兩個墊條放在玻璃板兩側，塗上少量凡士林，並將上層玻璃板置於墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其餘三邊應用防水膠帶密封。

(3) 根據玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，按下表配製溶液(100ml)。

將35μl TEMED加入100ml混合液中，混勻，然後均勻連續注入兩玻璃板空隙中。

(4) 立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。

(5) 室溫聚合1小時，梳齒下出現折光帶時，表明聚合反應已經完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙(用1×TBE浸泡)包蓋於凝膠頂部，置4℃保存1-2天。

(6) 拔去梳子，立即用水沖洗加樣孔。

(7) 除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅盡凝膠底部附著的氣泡。並用1×TBE溶液沖洗加樣孔；

(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩衝液(見表2-28)混合，並加入凝膠加樣孔中；

(9) 接通電源，正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時凝膠產生的熱量可造成DNA區帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈；

(10) 電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作台上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，並小心揭下凝膠，置染色液中染色並進行結果觀察。

3.凝膠的染色和觀察　聚丙烯醯胺凝膠中核酸帶的染色，常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。

銀染法的靈敏度較高，可如下操作：

(1) 將凝膠置固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中固定10分鐘；

(2) 雙蒸水洗1-2次；

(3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中，室溫反應15-30分鐘；

(4) 充分水洗；

(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH，含1ml甲醛)中反應至條帶顯色清晰，本底適宜；

(6) 用5%冰醋酸終止反應。

瓊脂糖凝膠電泳適合分離、純化200bp-50kB長度的核酸片段，廣泛應用於基因組提取與分析、載體構建、質粒提取等方面，解析度較低，相差100bp以內的核酸片段較難分離。

聚丙烯醯胺凝膠電泳適合分離1kB以下的小核酸片段，適用於序列分析與比對、核酶分析與鑒定、小片段核酸的提取與分析等方面解析度較高，可以精確分離相差十幾至幾十bp的小片段核酸分子。