熒光分析法

特點：靈敏度更高 10-10-10-12g/ml，應用不如UV廣泛。

應用：①直接熒光光度法

②作為HPLC的檢測器（用的多）

根據物質分子吸收光譜和熒光光譜能級躍遷機理，具有吸收光子能力的物質在特定波長光（如紫外光）照射下可在瞬間發射出比激發光波長長的光，即熒光。

SO2分子受特定光照射后處於激發態的SO2分子返回基態時發出熒光, 其熒光強度與SO2呈線性關係, 從而可測出氣體濃度。當檢測儀器系統確定后，熒光總光強I與SO2濃度的之間的關係可表示為：I=KC 在穩定的條件下，這些參數也隨之確定，k可視為常數。因此，式I=kC表示的紫外熒光光強I與樣氣的濃度C成線性關係。這是紫外熒光法進行定量檢測的重要依據。

利用物質自身發射的熒光進行測定分析

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由於有些物質本身不發射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發射熒光的物質轉化成能發射熒光的物質。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發射熒光的物質生成絡合物，各種絡合物能發射熒光，再進行測定。因此熒光試劑的使用，對一些原來不發熒光的無機物質和有機物質進行熒光分析打開了大門，擴展了分析的範圍。

不管是直接測定，還是間接測定，一般的採用標準工作曲線法，取各種已知量的熒光物質，配成一系列的標準溶液，測定出這些標準溶液的熒光強度，然後給出熒光強度對標準溶液的濃度的工作曲線。在同樣的儀器條件下，測定未知樣品的熒光強度，然後從標準工作曲線上查出未知樣品的濃度（即含量）。

一般常用的熒光分析儀器有：目測熒光儀（熒光分析燈），熒光光度計和熒光分光光度計三種。

熒光分析是一種先進的分析方法，它比電子探針法、質譜法、光譜法、極譜法等都應用的較廣泛和普及，這同熒光分析具有很多優點分不開的。熒光分析所用的設備較簡單，如目測熒光儀和熒光光度計構造非常簡單完全可以自己製造。比起質譜儀、極譜儀和電子探針儀來它在造價上要便宜很多倍，而且熒光分析的最大特點是：分析靈敏度高、選擇性強和使用簡便。同時具備這三大特點的儀器並不多。

熒光分析法的最大特點是靈敏度高，對某些物質的微量分析可以檢測到10克數量級，如污水中的銀含量用熒光分析法可以檢測到1x10克，汞可以檢測到1x10克。對一些激素亦可檢測到10克。熒光分析的靈敏度比分光光度法的靈敏度高2~3個數量級，這是由於熒光分析的熒光和入射光之間成直角，而不在一條直線上，所以是在黑背景下檢測熒光。而分光光度法的接收器與入射光在一條直線上，所以它是在亮背景下檢測。因此熒光分析法比分光光譜法靈敏度高。分光光譜法的靈敏度一般只能檢測到10克，兩者相差三個數量級。當然熒光分析法比起帶電子顯微鏡的電子探針法靈敏度又低一些（它可達10克數量級），然而電子探針儀器價格昂貴，使用不方便。

熒光分析的第二個特點是選擇性強，特別是對有機化合物而言。因熒光光譜既包括激發光譜又包括發射光譜，凡是能發射熒光的物質，必須首先吸收一定波長的紫外線，而吸收了紫外線后不一定就發射熒光。能發射熒光的物質，其熒光波長也不盡相同。如果即使熒光光譜相同的話，而它的激光光譜也不一定相同。反之如果它們的激發光譜相同，則可用發射光譜把它們區分開來，因此供選擇的餘地是比較多的。所以熒光分析的選擇性很強。例如有兩種物質，它們的熒光光譜很相似，不易把它們分開。但它們的激光光譜不會相同，因此就可用掃描激光光譜把它們分開。如果用分光光譜法就難以辦到這一點，因為分光光譜只能得到待測物質的特徵吸收光譜。所以分光光譜法的選擇性就沒有熒光分析法強。

根據波茲曼 （Boltzmann）分佈，分子在室溫時基本上處於 電子能級的基態。當吸收了紫外-可見光后，基態分子中的電子只能躍遷到激發單重態的各個不同振動-轉動能級，根據自旋禁阻選律, 不能直接躍遷到激發三重態的各個振動-轉動能級。

處於激發態的分子是不穩定的，通常以輻射躍遷和無輻射躍遷等方式釋放多餘的能 量而返回至基態，發射熒光是其中的一條途徑。

振動弛豫（vibrational relexation）

是處於激發態各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰攛而將部分振動能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發態的最低振動能級的過程。由於能量不是以光輻射的形式放出，故振動弛豫屬於無輻射躍遷。振動弛豫只能在同一電子能級內進行，發生振動弛豫的時間約為 秒數量級。

內部能量轉換（ internal conversion）

簡稱內轉換，是當兩個電子激發態之間的能量相差較小以致其振動能級有重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉移至低電子能級的過程。

熒光發射

無論分子最初處於哪一個激發單重態，通過內轉換及振動弛豫，均可返回到第一激發單重態的最低振動能級，然後再以輻射形式發射光量子而返回至基態的任一振動能級上,這時發射的光量子稱為熒光。由於振動弛豫和內轉換損失了部分能童，故熒光的波長總比激發光波長要長。發射熒光的過程為 秒。由於電子返回基態時可以停留在基態的任一振動能級上，因此得到的熒光譜線有時呈現幾個非常靠近的峰。通過進一步振動弛豫，這些電子都很快地回到基態的最低振動能級。

外部能量轉換（ external conversion）

簡稱外轉換，是溶液中的激發態分子與溶劑分子或與其他溶質分子之間相互碰撞而失去能量，並以熱能的形式釋放能量的過程。外轉換常發生在第一激發單重態或激發三重態的最低振動能級向基態轉換的過程中。外轉換會降低熒光強度。

體系間跨越（interaystem crossing）

是處於激發態分子的電子發生自旋反轉而使分子的多重性發生變化的過程。分子由激發單重態跨越到激發三重態后，熒光強度減弱甚至熄滅。含有重原子如碘、溴等的分子時，體系間跨越最為常見，原因是在髙原子序數的原子中，電子的自旋與軌道運動之間的相互作用較大，有利於電子自旋反轉的發生。另外，在溶液中存在氧分子等順磁性物質也容易發生體系間跨越，從而使熒光減弱。

磷光（ phosphorescence）發射

經過體系間跨越的分子再通過振動弛豫降至激發三重態的最低振動能級，分子在激發三重態的最低振動能級可以存活一段時間，然後返回至基態的各個振動能級而發出光輻射，這種光輻射稱為磷光。由於激發三重態的能級比激發單重態的最低振動能級能M低 ，所以磷光輻射的能量比熒光更小，亦即磷光的波民比熒光更長。因為分子在激發三重態的壽命較長，所以磷光發射比熒光更遲，需 要 秒或更長的時間。由於熒光物質分子與溶劑分子間相互碰撞等因素的影響，處於激發三重態的分子常常通過X 輻射過程失活回到基態，因此在室溫下很少呈現磷光，只有通過冷凍或固定化而減少外轉換才能檢測到磷光，所以磷光法不如熒光分析法普遍。 

有機物質的熒光分析

有機化合物的熒光分析應用很廣泛，能測定的有機物質有數百種之多，如酶和輔酶的熒光分析，農藥和毒藥的熒光分析，氨基酸和蛋白質的熒光分析，核酸的熒光分析。這些構成了熒光分析技術的主要內容。許多有機化合物在紫外線的照射下，所發熒光並不強或不發熒光，因此必須使用某些有機試劑，以便生成的產物在紫外線照射下能發射強的熒光。例如脂肪族有機化合物就是用間接方法測定的。

無機元素的熒光分析

在紫外線照射下能直接發射熒光的化學元素並不很多，所以對一些元素進行熒光分析時大部分採用間接測定法，這就是用有機試劑與被測定的元素組成絡合物。這些絡合物在紫外線照射下能發射出不同波長的熒光素，然後由熒光強度測定出該元素的含量。由於有機熒光試劑的品種繁多，用熒光分析可測定的元素有六十多種。

例如對鉛的熒光分析：鉛離子Pb與Cl離子組成鉛氯絡合物，該絡合物在短波紫外光270毫微米激發下，它會發射出藍色熒光，熒光峰值波長在480毫微米，根據熒光強度在標準工作曲線上測定出Pb的含量。該法能測定0.1~0.6微克鉛/毫升。