蛋白質晶元

蛋白晶元技術的研究對象是蛋白質，其原理是對固相載體進行特殊的化學處理，再將已知的蛋白分子產物固定其上（如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等），根據這些生物分子的特性，捕獲能與之特異性結合的待測蛋白（存在於血清、血漿、淋巴、間質液、尿液、滲出液、細胞溶解液、分泌液等），經洗滌、純化，再進行確認和生化分析；它為獲得重要生命信息（如未知蛋白組分、序列。體內表達水平生物學功能、與其他分子的相互調控關係、藥物篩選、藥物靶位的選擇等）提供有力的技術支持。

固體晶元的構建

常用的材質有玻片、硅、雲母及各種膜片等。理想的載體表面是滲透濾膜（如硝酸纖維素膜）或包被了不同試劑（如多聚賴氨酸）的載玻片。外形可製成各種不同的形狀。Lin，SR等人引採用APTS-BS3技術增強晶元與蛋白質的結合。

探針的製備

低密度蛋白質晶元的探針包括特定的抗原、抗體、酶、吸水或疏水物質、結合某些陽離子或陰離子的化學集團、受體和免疫複合物等具有生物活性的蛋白質。製備時常常採用直接點樣法，以避免蛋白質的空間結構改變。保持它和樣品的特異性結合能力。高密度蛋白質晶元一般為基因表達產物，如一個cDNA文庫所產生的幾乎所有蛋白質均排：列在一個載體表面，其芯池數目高達1600個/cm2，呈微距陣排列，點樣時須用機械手進行，可同時檢測數千個樣品。

生物分子反應

使用時將待檢的含有蛋白質的標本如尿液、血清、精液、組織提取物等，按一定程序做好層析、電泳、色譜等前處理，然後在每個芯池裡點入需要的種類。一般樣品量只要2-10μL即可。

根據測定目的不同可選用不同探針結合或與其中含有的生物製劑相互作用一段時間，然後洗去未結合的或多餘的物質，將樣品固定一下等待檢測即可。

信號檢測分析

直接檢測模式是將待測蛋白用熒光素或同位素標記，結合到晶元的蛋白質就會發出特定的信號，檢測時用特殊的晶元掃描儀掃描和相應的計算機軟體進行數據分析，或將晶元放射顯影后再選用相應的軟體進行數據分析。間接檢測模式類似於ELISA方法，標記第二抗體分子。以上兩種檢測模式均基於陣列為基礎的晶元檢測技術。該法操作簡單、成本低廉，可以在單一測量時間內完成多次重複性測量。國外多採用[color=#990000][b]質譜[/b][/color](massspectrometry．MS）分析基礎上的新技術，如表面加強的激光離子解析一飛行時間質譜技術（SELDI-TOF-MS），可使吸附在蛋白質晶元上的靶蛋白離子化，在電場力的作用下計算出其質量電荷比，與蛋白質資料庫配合使用，來確定蛋白質片段的分子量和相對含量，可用來進行檢測蛋白質譜的變化。光學蛋白晶元技術是基於1995年提出的光學橢圓生物感測器的概念。利用具有生物活性的的晶元上靶蛋白感應表面及生物分子的特異性結合性，可在橢偏光學成像觀察下直接測定多種生物分子。

蛋白晶元主要有三類：蛋白質微陣列、微孔板蛋白質晶元、三維凝膠塊晶元等。

蛋白質微陣列

哈佛大學的Macbeath和SchreiberL等報道了：通過點樣機械裝置製作蛋白質晶元的研究，將針尖浸入裝有純化的蛋白質溶液的微孔中，然後移至載玻片上，在載玻片表面點上1nl的溶液，然後機械手重複操作，點不同的蛋白質。利用此裝置大約固定了10，000種蛋白質，並用其研究蛋白質與蛋白質間，蛋白質與小分子間的特異性相互作用。Macbeath和Schreiber首先用一層小牛血清白蛋白（BSA）修飾玻片，可以防止固定在表面上的蛋白質變性。由於賴氨酸廣泛存在於蛋白質的肽鏈中，BSA中的賴氨酸通過活性劑與點樣的蛋白質樣品所含的賴氨酸發生反應，使其結合在基片表面，並且一些蛋白質的活性區域露出。這樣，利用點樣裝置將蛋白質固定在t3SA表面上，製作成蛋白質微陣列。

微孔板蛋白晶元

Mendoza等在傳統微滴定板的基礎上，利用機械手在96孔的每一個孔的平底上點樣成同樣的四組蛋白質，每組36個點（4×36陣列），含有8種不同抗原和標記蛋白。可直接使用與之配套的全自動免疫分析儀，測定結果。適合蛋白質的大規模、多種類的篩選。

三維凝膠塊晶元

三維凝膠塊晶元是美國阿貢國家實驗室和俄羅斯科學院恩格爾哈得分子生物學研究所開發的一種晶元技術。三維凝膠塊晶元實質上是在基片上點布以10000個微小聚苯烯醯胺凝膠塊，每個凝膠塊可用於靶DNA、RNA和蛋白質的分析。這種晶元可用於篩選抗原抗體、酶動力學反應的研究。該系統的優點是：凝膠條的三維化能加進更多的已知樣品，提高檢測的靈敏度；蛋白質能夠以天然狀態分析，可以進行免疫測定、受體、配體研究和蛋白質組分分析。

它具有以下優點：

⒈直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進行分析

⒉同時快速發現多個生物標記物

⒊小量樣品

⒋高通量的驗證能力

⒌發現低丰度蛋白質

⒍測定疏水蛋白質：與“雙相電泳加飛行質譜”相比，除了有相似功能外，並可增加測定疏水蛋白質

⒎在同一系統中集發現和檢測為一體特異性高利用單克隆抗體晶元，可鑒定未知抗原/蛋白質，以減少測定蛋白質序列的工作量。

8.可以定量利用單克隆抗體晶元，由於結合至晶元上的抗體是定量的，故可以測定抗原量，但一般飛行質譜不用於定量分析。

9.功能廣I.利用單克隆抗體晶元，可替代Western Blot，Ⅱ.利用單克隆抗體晶元，可互補流式細胞儀不足的功能，如將細胞溶解，可測定細胞內的抗原，而且靈敏度遠高於流式細胞儀）。

蛋白質晶元還面臨著諸多挑戰，未來的發展重點集中在以下幾個方面：

⑴建立快速、廉價、高通量的蛋白質表達和純化方法。

⑵改進基質材料的表面處理技術以減少蛋白質的非特異性結合。

⑶提高晶元製作的點陣速度；提供合適的溫度和濕度以保持晶元表面蛋白質的穩定性及生物活性。

⑷研究通用的高靈敏度、高解析度檢測方法。已經商品化的生物晶元多為微陣列晶元，而微流路晶元和晶元實驗室正處於研究階段。

基因表達的篩選

AngelikaL．等人從人胎兒腦的cDNA文庫中選出92個克隆的粗提物製成蛋白質晶元，用特異性的抗體對其也進行檢測，結果的準確率在87%以上，而用傳統的原位濾膜技術準確率只達到63%。與原位濾膜相比，用蛋白質晶元技術在同樣面積上可容納更多的克隆，靈敏度可達到pg級。

抗原抗體檢測

在CavinM．等人的實驗中，蛋白質晶元上的抗原抗體反應體現出很好的特異性，在一塊蛋白質晶元上10800個點中，根據抗原抗體的特異性結合檢測到唯一的1個陽性位點。Cavin M．指出，這種特異性的抗原抗體反應一旦確立，就可以利用這項技術來度量整個細胞或組織中的蛋白質的豐富程度和修飾程度。其次利用蛋白質晶元技術，根據與某一蛋白質的多種組分親和的特徵，篩選某一抗原的未知抗體，將常規的免疫分析微縮到晶元上進行，使免疫檢測更加方便快捷。

篩選及研究

常規篩選蛋白質主要是在基因水平上進行，基因水平的篩選雖已被運用到任意的cDNA文庫，但這種文庫多以噬菌體為載體，通過噬菌斑轉印技術（plaque life procedure）在一張膜上表達蛋白質。但由於許多蛋白質不是基因編碼，而且真核基因在細菌中往往不能產生正確摺疊的蛋白質，況且噬菌斑轉移不能縮小到毫米範圍進行，所以這種方法的局限性，靠蛋白質晶元彌補。酶作為一種特殊的蛋白質，可以用蛋白質晶元來研究酶的底物、激活劑、抑製劑等。

蛋白質晶元為蛋白質功能研究提供了新的方法，合成的多肽及來源於細胞的蛋白質都可以用作製備蛋白質晶元的材料。Uetz將蛋白質晶元引入酵母雙雜交研究中，大大提高了篩選率。建立了含6O0O個酵母蛋白的轉化子，每個都具有開放性可閱讀框架（Open Reading Frame，0FR）的融合蛋白作為酵母雙雜交反應中的激活區，此蛋白質晶元檢測到192個酵母蛋白與此發生陽性反應。

生化反應的檢測

對酶活性的測定一直是臨床生化檢驗中不可缺少的部分。Cohen用常規的光蝕刻技術製備晶元、酶及底物加到晶元上的小室，在電滲作用中使酸及底物經通道接觸，發生酶促反應。通過電泳分離，可得到熒游標記的多肽底物及產物的變化，以此來定量酶促反應結果。動力學常數的測定表明該方法是可行的，而且，熒光物質穩定。Arenkov進行了類似的試驗，他製備的蛋白質晶元片的一大優點，可以反覆使用多次，大大降低了試驗成本。

藥物篩選

疾病的發生髮展與某些蛋白質的變化有關，如果以這些蛋白質構築晶元，對眾多候選化學藥物進行篩選，直接篩選出與靶蛋白作用的化學藥物，將大大推進藥物的開發。蛋白質晶元有助於了解藥物與其效應蛋白的相互作用，並可以在對化學藥物作用機制不甚了解的情況下直接研究蛋白質譜。還可以將化學藥物作用與疾病聯繫起來，以及藥物是否具有毒副作用、判定藥物的治療效果，為指導臨床用藥提供實驗依據。另外，蛋白晶元技術還可對中藥的真偽和有效成分進行快速鑒定和分析。

疾病診斷

蛋白質晶元技術在醫學領域中有著潛在的廣闊應用前景。蛋白質晶元能夠同時檢測生物樣品中與某種疾病或者環境因素損傷可能相關的全部蛋白質的含量情況，即表型指紋（phenomic fingerprint）。表型指紋對監測疾病的過程或預測，判斷治療的效果也具有重要意義。Ciphelxen Biosystems公司利用蛋白質晶元檢測了來自健康人和前列腺癌患者的血清樣品，在短短的三天之內發現了6種潛在的前列腺癌的生物學標記。Englert將抗體點在片基上，與它檢測正常組織和腫瘤之間蛋白質表達的差異，發現有些蛋白質的表達，如前列腺組織特異抗原，明膠酶蛋白在腫瘤的發生髮展中起著重要的作用，這給腫瘤的診斷和治療帶來了新途徑。應用蛋白質晶元在臨床上還發現乳腺癌患者中的28.3KD的蛋白質；存在於結腸癌及其癌前病變患者的血清13.8KD的特異相關蛋白質。

蛋白質晶元還面臨著諸多挑戰，未來的發展重點集中在以下幾個方面：

（1）建立快速、廉價、高通量的蛋白質表達和純化方法，高通量製備抗體並定義每種抗體的親和特異性；第一代蛋白檢測晶元將主要依賴於抗體和其他大分子，顯然，用這些材料製備複雜的晶元，尤其是規模生產會存在很多實際問題，理想的解決辦法是採用化學合成的方法大規模製備抗體。

（2）改進基質材料的表面處理技術以減少蛋白質的非特異性結合。

（3）提高晶元製作的點陣速度；提供合適的溫度和濕度以保持晶元表面蛋白質的穩定性及生物活性。

（4）研究通用的高靈敏度、高解析度檢測方法，實現成像與數據分析一體化。

另外，微流路晶元、晶元實驗室與微陣列晶元技術並駕齊驅，是生物晶元技術的三駕馬車，並逐步實現產業化。目前已經商品化的生物晶元多為微陣列晶元，而微流路晶元和晶元實驗室正處於研究階段。