流式細胞儀

流式細胞儀主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統；激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統。上圖為其結構示意圖。

流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透明、穩定的材料製作。設計和製作均很精細，是液流系統的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩液，一般限制液流速度υ<10m/s。由於鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發生振動。

經特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發才能發出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據被激發物質的激發光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發射光譜大部分集中於300～400nm，很適合需要用紫外光激發的場合。氬離子激光器的發射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約佔總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發生改變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器，則可得到550～650nm連續可調的激光，尤在590nm處轉換效率最高，約可佔到一半。為使細胞得到均勻照射，並提高解析度，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散稜鏡用來選擇激光的波長，調整反射鏡的角度使調諧到所需要的波長λ。為了進一步使檢測的發射熒光更強，並提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就採用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

經熒光染色的細胞受合適的光激發后所產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應時間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200～900nm的光譜區，光量子產額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續調節，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩定性問題，工作電壓要十分穩定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低於0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應處理，並注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極體的，它在強光下穩定性比PMT好。

從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關係，稱為線性放大器。線性放大器適用於在較小範圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關係。在免疫學測量中常使用對數放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差1～2個數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器採集數據易於解釋。此外還有調節便利、細胞群體分佈形狀不易受外界工作條件影響等優點。

經放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數是和電信號的脈衝高度相對應的，也是和光信號的強弱相關的。對應道數年縱坐標通常代表發出該信號的細胞相對數目。多道分析器出來的信號再經模-數轉換器輸往微機處理器編成數據文件，或存貯於計算機的硬碟和軟盤上，或存於儀器內以備調用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數。存貯於計算機內的數據可以在實測后離線重現，進行數據處理和分析，最後給出結果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

下面分別簡要介紹流式細胞儀有關的參數測量、樣品分選及數據處理等工作原理。

流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分佈與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特徵性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於光學性質的改變，其散射光信號當然不同於活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。

在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角範圍內基本上和截面積大小成線性關係；對於形狀複雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發出的熒光；②特徵熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為雜訊信號，在多數情況下會幹擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對於結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。

減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統；③採用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。

流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而後由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有採用捕獲管來進行分選的。

穩定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數百μm。實驗經驗公式f=v/4.5d給出形成穩定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈衝發生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經邏輯選擇再到脈衝充電需要一段延遲時間，一般為數十ms。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，儀器多採用移位寄存器數字電路來產生延遲。可根據具體要求予以適當調整。

（50）數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至於對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

①數據顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。

直方圖是一維數據用作最多的圖形顯示形式，既可用於定性分析，又可用於定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據選擇放大器類型不同，坐標可以是線性標度或對數標度，用“道數”來表示，實質上是所測的熒光或散射光的強度。坐標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數與細胞之間的關係是它的局限性。

二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關係。坐標和坐標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應坐標值的細胞存在（圖10-3）。可以由二維點圖得到兩個一維直方圖，但是由於兼并現象存在，二維點圖的信息量要大於二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難於顯示它的精細結構。

圖10-2直方圖圖10-3二維點圖

二維等高圖類似於地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。

假三維圖是利用計算機技術對二維等高圖的一種視覺直觀的表現方法。它把原二維圖中的隱坐標—細胞數同時顯現，但參數維圖可以通過旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結構和細節，這無疑是有助於對數據進行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。

圖10-4二維等高圖圖10-5假三維圖

列表模式其實只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數數據顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用ListMode中的特殊技術，開窗或用游標調出相關部分再改變維數進行顯示。例如，“一調二”就是在一維圖上調出二維圖來；“二調一”就是從二維圖中調出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。

圖10-6從二維圖設窗調出直方圖示意

上面簡要地介紹了幾種數據顯示形式，在實際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得儘可能多的有用信息。

②數據分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型技術時則多使用參數方法。數學模型可以是一個方程或方程組，方程的參數產生所需要的信息來自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分佈。如果採用正態分佈函數來描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標準偏差。方程的數據擬合則通常使用最小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分佈形狀不需要做任何假設，即採用無設定參數分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數分佈；也可能很複雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。

逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統）是大家常用的數據分析的重要手段。我們常可以用來了解數據的特性、尋找那些不曾預料的特異徵兆、選擇統計分析的模型、顯示最終結果等。事實上，不經過先對數據進行直觀觀察分析就決不應該對這批數據進行數值分析。從這一點來看，非參數分析是參數分析的基礎。

逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設置應根據整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結果曲線”往往是適宜的。

因為數據分析往往和結果解釋關係十分密切，也就是說和生物學背景相關，因此具體的分析法和原理將在後面結合實例再介紹。

為了表徵儀器性能，往往根據使用目的和要求而提出幾個技術參數或指標來定量說明。對於流式細胞儀常用的技術指標有熒光解析度、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數等。

強度一定的熒光在測量時是在一定道址上的一個正態分佈的峰，熒光解析度是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異係數（C.V值）來表示。C.V的定義式為：

C.V=σ/μ

式中，σ為標準偏差，μ是平均值。

在實際應用中，我們使用挖關係式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。現在市場上儀器的熒光解析度均優於2.0%。

反映儀器所能探測的最小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate異硫氰基熒光素）的最少分子數來表示。現在市場使用儀器均可達到1000左右。

儀器每秒種可分析/分選的數目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。

主要給出儀器工作時樣品濃度的適用範圍。一般在1010細胞/ml的數量級。

其它技術參數尚多，不再一一介紹。

古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應用流式細胞分析和分選技術，必需先對儀器進行調試，使其處於良好的工作狀態，並能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調試項目及要點、使用的程序等等。

流式細胞儀在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調試，以保證工作的可靠性和最佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區的光路等。

激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。

液流速度：可通過操作台數字顯示監督，調節氣體壓力大小以獲得穩定的液流速度。

測量區光路調節：這是調試工作的關鍵。需要保證在測量區的液流、激光束、90散射測量光電系統垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。

流式細胞術中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的准直調整和定量標度。標準樣品應該穩定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。微球用樹脂材料製作，或標有熒光素，或不標記熒光素。所用的雞血紅細胞標準樣品製作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最後經PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發熒光。

①打開電源，對系統進行預熱；

②打開氣體閾，調節壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統；

③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統；

④利用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度最強，並要求變異係數為最小；

⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；

⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統；

⑦因為實驗數據已存入計算機硬碟（有的機器還備有光碟系統，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；

⑧將所需結果列印出來。

1）光電倍增管要求穩定的工作條件，暴露的較強的光線下以後，需要較長時間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

2）光源不得在短時間內（一般要1h左右）關上又打開；使用光源必須預熱並注意冷卻系統工作是否正常；

3）液流系統必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經過過濾、消毒；

4）注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類型等；

5）特彆強度每次測量都需要對照組。

1.分析細胞表面標誌

2.分析細胞內抗原物質

3.分析細胞受體

4.分析腫瘤細胞的DNA、RNA含量

5.分析免疫細胞的功能

包括NGS、ddPCR、CTC，還有ctDNA等。