熒光探針

熒光探針分類很多，可以根據材料屬性分為有機和無機探針，可以根據探針尺寸分為分子探針和納米探針，也可以根據激發光源分為單光子、雙光子及多光子熒光探針，還可以根據待測物分類為金屬離子熒光單子和生物分子熒光探針等等。熒光探針在各種檢測和標記中應用廣泛，比如測定金屬離子、農藥殘留、生物分子含量、示蹤生物分子，標記大分子及細胞和亞細胞結構等方面。

與核酸(DNA或RNA)、蛋白質或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種熒光性質發生改變的小分子物質。可用於研究大分子物質的性質和行為。

熒光定量PCR所使用的熒光化學製劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

實時熒光PCR技術靶基因的確定及引物和探針的設計原則：

1．靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性(漏檢)。

2．檢測片段的確定：選擇檢測組內的保守(突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列(突變多)（避免假陽性）作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。

3．引物：長度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩定的引物二聚體（特別是多聯檢測）及髮夾結構(自由能大於-3.5kc/m)；序列不能出現連續的G，3’端避免G或C，最後5個鹼基內避免兩個以上的G或C。

4．探針：長度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩定的二聚體及髮夾結構(自由能大於-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大（多聯檢測）或Fam(單聯檢測）的熒游標記。

最常用於熒光免疫法中標記抗原或抗體，亦可用於微環境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質活性位點等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光係數大，熒光量子產率高；熒光發射波長處於長波且有較大的斯托克斯位移；用於免疫分析時，與抗原或抗體的結合不應影響它們的活性。

也可用於標記待定的核苷酸片斷，用與特異性地、定量地檢測核酸的量。

目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點、分子信標等。熒光探針除應用於核酸和蛋白質的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術以及DNA測序上都有著廣泛的應用。

目前，檢測熒光探針的方法主要有單點測定和電荷耦合裝置（CCD）熒光成像（包括用於微區分析的激光共聚焦熒光顯微鏡成像）。由於光電倍增管點掃描時間較長，激光照射強度高，很難抓住熒光早期變化。而CCD熒光成像的面陣大，成像視野廣，成像時間可以調節，因而檢測效果比較好。

化學發光檢測的最大特點是設備簡單、操作簡便、分析速度快及靈敏度高。化學發光成像分析(CLI)是將化學發光與成像技術相結合，從而具有解析度高、多樣品同時檢測、光譜響應範圍寬以及靈敏度高等特點[10,11]，已廣泛應用於凝膠、蛋白印記及微陣列晶元中的化學發光信號檢測。本實驗建立了TCPO?咪唑?H2O2?熒光探針化學發光成像體系。由於化學發光不需要任何光源，因而在對熒光探針進行化學發光成像檢測時，不存在熒光檢測或者熒光成像時不可避免的光學背景的干擾，從而可以獲得更低的檢出限。用此體系對5種熒光探針進行定量分析，並研究了用四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記的單克隆羊抗人IgG的化學發光成像，檢出限達10mol/L，比相同條件下熒光成像的檢出限低一個數量級。