瑞氏染色

用瑞氏染料染色的染色方法

瑞氏染色是目前最常用而又最簡單的染色方法。瑞氏試劑中之酸性伊紅和鹼性美藍混合經化學作用后,變成中性之 伊紅化美藍,久置后,經氧化而含有天青。此三種染料分別和細胞核及漿中的NH3+和COO-等結合,使細胞核及胞漿著色。由於系中性染料,又有緩衝液調節酸鹼度,所以細胞受染后,藍紅等顏色都較適中,核染質、胞漿及其中之顆粒顯色較為清楚。

理化原理


瑞氏染料是由鹼性染料美藍( Methvlem blue )和酸性染料黃色伊紅( Eostm Y )合稱伊紅美藍 染料即瑞氏(美藍-伊紅Y)染料。伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子,無色部分為陽離子,其有色部分為酸性,故稱伊紅為酸性染料。美藍通常為氯鹽是鹼性的,美藍的中間產物結晶為三氯化鎂復鹽,其有色部分為陽離子,無色部分為陰離子,恰與伊紅鈉鹽相反。

染液配製


溶劑

用 甲醇作瑞氏 染料溶劑,即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑,有兩種作用:
( 1 )甲醇使瑞氏染料中美藍( M )與伊紅( E )在溶液中離解,可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而著色。在配製的瑞氏染液中美藍如放置過久即可氧化而含有天青,美藍天青與伊紅化合物能使核染成紫紅色,但不能使胞漿染為藍色,多餘 美藍就可以 使胞漿染成藍色,染色主要是化學作用,是離子彼此結合的反應。
( 2 )甲醇具有強大的脫水力,可將細胞固定在一定形態及增加細胞結構的表面積,提高細胞對染料吸收作用,同時由於甲醇吸附染色液中的水,使染色液升溫,加速染色反應。
瑞氏染液配製:
瑞氏染料 830gm 或 1g
甲醇( AR ) 500ml 或 600ml
先稱乾燥(事先放入溫箱乾燥過夜)瑞氏染料放置乳缽內,用乳棒輕輕 敲碎染料成粉末,再行研磨至聽不到 研芝麻聲 即呈細粉末,加少許甘油或甲醇溶解研磨,使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤,而無染料粉粒沉著,再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮,靜置片刻,將上層液體倒入 一 清潔儲存瓶內(最好用甲醇空瓶),再加甲醇研磨,重複數次,直至乳缽內染料及甲醇用完為止,搖勻,密封瓶口,存室溫暗處,儲存愈久,則染料溶解、分解就越好,一般儲存 3 個月以上為佳。

緩衝液

1) 緩衝液作用:染色對氫離子濃度是十分敏感的,據觀察 pH 值的改變,可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。緩衝液須保持 一定的 pH 使染色穩定, PBS 的 pH 一般在 6.4~6.8 ,偏鹼性染料可與緩衝液中 酸基起 中和作用,偏酸性染料則與緩衝液中的鹼基起中和作用,使 pH 恆定。
2) 緩衝液配製( pH6.4~6.8 ,弱酸性):
配方 1 :配方 2 :
1% KH 2 PO 4 30ml M/15 KH 2 PO 4 73.5 ml
1% Na 2 HPO 4 20ml M/15 Na 2 HPO 4 26.5ml
H 2 O( 新鮮 ) 加至 1000ml
置室溫黑暗處,瓶口密封,防止黴菌污染,如有污染則應報廢。