新冠病毒核酸檢測

所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，新型冠狀病毒是一種僅含有RNA的病毒，病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標誌物。新型冠狀病毒出現后，我國科學家在極短的時間裡完成了對新型冠狀病毒全基因組序列的解析，並通過與其它物種的基因組序列對比，發現了新型冠狀病毒中的特異核酸序列。臨床實驗室檢測過程中，如果能在患者樣本中檢測到新型冠狀病毒的特異核酸序列，應提示該患者可能被新型冠狀病毒感染。

檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應)。因PCR反應模板僅為DNA，因此在進行PCR反應前，應將新型冠狀病毒核酸(RNA)逆轉錄為DNA。在PCR反應體系中，包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。

對於新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據試劑盒說明書樣本要求部分進行樣本採集，常規的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。

獲得患者樣本后，需儘快進行檢測，如無法立即檢測需要轉運的樣本，應按照說明書的要求進行低溫封裝，並送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本后，對樣本進行核酸提取，核酸提取試劑應使用批准產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。

病毒RNA需要首先逆轉錄為cDNA，再進行擴增檢測。PCR擴增和檢測應使用批准產品說明書中指定的熒光定量PCR儀，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

上述過程中樣本的採集、保存、轉運，樣本核酸的提取和檢測、結果的判讀均須嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

每個病例必須採集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本或下呼吸道標本），重症病例優先採集下呼吸道標本；根據臨床需要可留取便標本、全血標本、血清標本和尿標本。

標本種類：

1.上呼吸道標本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。

2.下呼吸道標本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。

3.徠便標本/肛拭子：留取糞便標本約10克（花生大小），如果不便於留取便標本，可採集肛拭子。

4.血液標本：盡量釆集發病後7天內的急性期抗凝血，採集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管採集血液。

5.血清標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應儘早（最好在發病後7天內）釆集，第二份血清應在發病後第3～4周釆集。採集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標本主要用於抗體的測定，不進行核酸檢測。

6.尿標本：留取中段晨尿，採集量2～3ml。

1.鼻咽拭子：採樣人員一手輕扶被採集人員的頭部，一手執拭子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向後緩緩深入，由於鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔後壁時，輕輕旋轉一周（如遇反射性咳嗽，應停留片刻），然後緩緩取出拭子。

2.咽拭子：被採集人員先用生理鹽水漱口，採樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤（禁止將拭子放入病毒保存液中，避 3 免抗生素引起過敏），被採集人員頭部微仰，嘴張大，併發“啊”音，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被採集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然後再在咽後壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩衝液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置於同一管中。

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部並緩慢退出，收集抽取的粘液，並用3ml採樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。

4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集於含3ml 採樣液的採樣管中。如果痰液未收集於採樣液中，可在檢測前，加入2～3ml採樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。使用時將儲存液用去離子水稀釋至50 ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也可採用痰液等體積的 含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩衝液將痰液化。

5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部並緩慢退出，收集抽取的粘液，並用採樣液沖洗收集器1次，也可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集。

6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50 ml，總量100～250ml，不應超過300ml。

7.糞便標本：取1ml標本處理液，挑取黃豆粒大小的便標本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩衝液溶解便標本製備便懸液。如患者出現腹瀉癥狀，則留取糞便標本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。

8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3～5cm，再輕輕旋轉拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋採樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。

9.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管採集血液標本5ml，根據所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10 分鐘，收集上清於無菌螺口塑料管中。

10.血清標本：用真空負壓采血管採集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清於無菌螺口塑料管中。

其他材料：依據設計需求規範採集。

實時熒光RT-PCR方法

結果判斷

陰性：無Ct值或Ct為40。

陽性：Ct值<37，可報告為陽性。

灰區：Ct值在37-40之間，建議重複實驗，若重做結果Ct值 <40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

註：如使用商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。

病例確認

實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：

1.同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新採樣，重新檢測。如果仍然為單靶標陽性，判定為陽性。

2.兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現單靶標陽性，或同種類型標本兩次採樣檢測中均出現單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。核酸檢測結果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位 的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

血清抗體檢測（膠體金、磁微粒化學發光、ELISA）用作新型冠狀病毒核酸檢測陰性病例的補充檢測，在疑似病例診斷中與核酸檢測協同使用，或用於人群血清學調查和既往暴露調查。

實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：

1.血清新型冠狀病毒IgM和IgG抗體陽性；

2.血清新型冠狀病毒IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急 性期有4倍及以上升高。發病後7天內的急性期抗凝血用於IgM和IgG檢測，如果檢測結果陰性，建議發病後10天內再次採集進行檢測。發病後3-4周恢復期血清用於IgG檢測。

註：如果採用商品化試劑盒，則以廠家說明書為準。

核酸檢測的“假陰性”是指從患者的臨床癥狀、肺部影像學結果甚至流行病學史都支持為新冠肺炎，但患者病毒核酸檢測結果為“陰性”，檢測結果與臨床不符。

核酸檢測的“假陽性”是指患者本來沒感染新冠病毒，但核酸檢測出現陽性結果。此“假陽性”的出現通常是由於實驗室檢測過程中標本間的交叉污染或實驗室核酸污染造成的。在技術層面上講，只要實驗室嚴格落實質控工作，可有效避免“假陽性”的產生。

通常“假陰性”產生原因為：

1.病毒入侵人體初期，人體內病毒量尚未達到可檢測的程度。在病毒潛伏期、輕度癥狀、嚴重癥狀的不同時期，人體的不同部位（如鼻咽部、口咽部、氣管、支氣管和肺泡）的病毒載量會存在差異。所以，採樣時機和採樣部位的不同，可能導致所採集的標本中沒有足夠量的病毒；

2.任何檢測試劑都有其檢測下限（即敏感性），如果患者標本內的病毒達不到所使用試劑的檢測下限，則會出現假陰性；

3.實驗室儀器設備性能和人員檢測能力差、質量管理落實不到位等也會產生“假陰性”；

4.採樣不規範、採集部位不當、採集標本不典型，導致標本中被病毒感染的細胞太少或沒有。即可能造成“假陰性”。

2021年6月8日至7月13日，梁河警方聯合梁河邊境檢查站、河西邊境檢查站連續查獲43起變造或使用變造核酸檢測證明的行政案件，抓獲違法嫌疑人61人，涉案人員全部行政拘留。

2021年8月，德國政府宣布將從10月起停止向全體民眾提供免費新冠病毒檢測，以期進一步推動新冠疫苗接種。